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氮和磷对浅水水库中的浮游植物的共同限制作用：以磷的限制作用作为范例作者：斯蒂芬妮·缪勒·M·米特洛维奇2013年9月16日接收，2014年10月7日修订，2014年10月12日被修订，2014年11月四日在线出版，2014年瑞士斯普林格国际出版社。摘要磷的限制作用被认为是淡水系统中的一个规则，也是控制浮游植物增长的基础。格雷尔姆斯顿水坝是一个中营养的浅水水库，我们猜想在格雷厄姆斯顿水坝中的浮游植物增长在不同季节和不同实验性时标的限制营养元素都为磷。在不同的季节现场指导七个附加氮和磷的完全因子微观实验。此次长时间跨度实验的影响将会在两个18天的中型实验中进行测试。氮和磷元素的共同添加比控制处理其中一个单一因子的实验更能诱发单个藻类的浮游植物生物量和生物体积的增长。在水中添加磷的微观试验中会出现一些重要的反应。在中型试验中，一些物种首先是对氮和磷的联合添加做出反应，然后才是对磷的单独添加做出反应。我们的结果显示，磷不是在所有的季节里都是限制性营养元素，但浮游植物生长最受限制的营养元素是氮和磷。一个更长实验性的时间跨度也没有改变生物量水平的结果，这表明加入氮和磷都是控制浮游植物生长的方法。关键词营养共限制作用藻类爆发蓝藻细菌水库管理介绍浮游植物大量增殖，特别是由有毒的蓝藻细菌主导的增殖，由于产生强有力的毒素会对饮用水的供应造成严重后果。因此，饮用水管理的目标之一就是控制造成浮游植物增长的原因——向水中排放大量富营养元素氮和磷。在这两种主要的营养元素中，磷一直是淡水系统营养管理的焦点，减少湖泊和水库中磷的排放在许多案例中成功的藻类和蓝藻的生物量。但是，氮的单独作用同样可以限制浮游植物的生产效率，而且越来越多的证据表明有时会出现两中营养元素对浮游植物的共限制作用。因此在某些湖泊，控制氮元素的含量也和控制磷元素一样重要。而且营养元素的限制作用也会出现季节性的变化，同时不同的湖泊也会出现不同的情况。尽管磷的限制作用会出现在一年中的大部分时间，但有时会在春季出现磷和硅酸盐的共限制作用，在秋季会出现氮和磷的共限制作用。研究者发现，在磷为主要限制因素的湖泊中，有些月份，氮和磷都不成为限制因素，而剩下的月份氮成了唯一的限制性因素。相反由氮作为主要限制因素的湖泊在初夏的一小段时间内磷会成为主要限制因素，随后在转向氮成为主要限制因素前会有一段氮和磷共同限制的时间。因为在藻类生长阶段限制性营养因素的改变对藻类爆发的形成至关重要，所以在这些改变发生前或发生时控制某一特定的营养元素可能非常重要，而更为重要的是要在这一年剩下的时间内控制其他营养元素。无论浮游植物的增长是有氮或者磷控制的，对其评估通常都是用原地富营养化实验。基于李比希最小因子定律，能引起浮游植物生物量最大限度增长的营养物质被认为是其增长的限制性因子。生物量的增长通常由叶绿素a来确定，少数情况由细胞总数来确定。原地富营养化实验从空间到时间都有很大变化，涉及对整个富营养化的湖从事数年的研究到很小体积的几天的微观实验。过去从微观实验推断整个生态系统的过程受到质疑。辛德勒和卡彭特提出像微观实验那样在时间和空间上降低尺度会得出生态学角度的不切实际的结果。他们的理由包括排除了群落的特殊性和忽视了进化的缓慢过程。但是，研究表明在富营养化的研究中，藻类对体积和比表面积的反应并不会有强烈的变化，即使是像几升水到一个小池塘的中型实验也是如此。因此，小型实验所检测的浮游植物对营养物质的直接反应可以合理的代表大规模实验所出现的情况。考虑到环境影响，成本和复制能力，微型实验是调查饮用水储存点限制性营养因子的最优选择。时间尺度在富营养化实验的结果中占有重要地位。在11天的瓶中实验发现生物总量首先受到氮元素含量的限制，接着不会受到营养元素的限制，最后会受到磷元素的限制。斯皮瓦克等人同样在他们七天的试验中提出藻类对营养富集的反应随时间的变化呈现明显的不同，物种水平上的生长反应比总体的生长或生物量的增长更容易受到时间的影响。每一个浮游植物种群在一定的生长条件下，例如温度，光照和有效营养成分，都有其最优的生长速率。不同物种的最优生长速率的巨大差异导致不同物种在相同条件下生长速率的不同。这对考虑物种水平上的生长反应是否能用来预测有害物种的生长是很重要的。特别是在相似的温度模式下，蓝藻门的生长速率比绿藻门的生长速率缓慢，这就表明蓝藻门对营养富集的反应可能不会被快速检测到。格雷厄姆斯顿水坝是澳大利亚东南部的一个中营养浅水饮用水水库，我们检测了格雷厄姆斯顿水坝中氮和磷对浮游植物的限制作用。这个水库有一个小的天然的森林集水，当需要的时候会从附近的河流用泵抽水来保持水位。这一过程会将营养物质带出湖泊中，因为河中营养物质的浓度比湖中更高。湖中存在着潜在的有毒的蓝藻细菌，但它不是湖中浮游植物的优势种。但是，可以确定的是水中营养物质的增加会导致蓝藻细菌的爆发。我们的目标是在群落和种群的基础上找到限制浮游植物生长的营养元素，从而确定限制性营养因子是否随季节变化而不同，同时在群落和种群水平上检验的不同实验阶段是否影响浮游植物对营养富集的反应。方法研究地点格雷厄姆斯顿大坝是位于澳大利亚新南威尔士东海海岸纽卡斯尔北面20公里处的一个浅水水库。其28平方公里的湖面提供了一个很大的风浪区，使湖水得到很好的混匀，同时湖水较浅处平均深度为7米。在夏季时，湖水的短期温度分层可以持续21天。由73平方公里的集水区有时可能无法满足饮用水的要求。作为补充，可从湖泊北部的威廉姆斯河抽取水来保持湖面水位。因为河水中的营养物质浓度高于湖水，所以这一过程会导致湖水营养物质含量的上升。根据国际经济与发展组织的规定，这个湖目前被列为中营养湖。在这次研究中所选的三种不同的位置都各有独特的环境特点。3点接近布雷克罗运河，是最浅的，也是保护最好的地点（深度4-6米，依赖湖水的容量）。2点接近湖的中心，风力最大且最深的地方（9-10米）。1点接近饮用水取水地，深度为7到9米。每个地点都用浮标长期标记。格雷厄姆斯顿大坝中经过滤后氮氧化物和溶解性磷化物的浓度范围分别是8-50/gL和5-30/gL。和湖中的水相比，威廉姆斯河中氮和磷的浓度高于湖水，而湖中的水是由威廉姆斯河经布雷克罗运河进入湖中的。河中氮氧化物和溶解性磷化物的浓度范围分别是66-450/gL和31-120/gL。湖中的浮游植物中生物量占主导地位的是绿藻类和硅藻类，个体数量占主导地位的是无毒的蓝藻类。湖中存在潜在的有毒的蓝藻门中的囊藻属，项圈藻属，丝囊藻属。囊藻属的细胞密度通常在1000个/ml左右，而项圈藻的细胞密度很少能达到1000个/ml。从1992年以来，在两种不同的情况下，囊藻属的细胞密度可以一直增长超过30000个/ml，项圈藻的细胞密度可以超过20000个/ml，然而丝囊藻直到2000年以后才被偶尔的记录。微观富营养化实验为了确定浮游植物生长的限制性营养因素和其随季节潜在的变化，原地富营养化微观实验在三个位置分别于2009年4月，2009年8月，2010年2月，图表1三个实验位置的的地点，在格雷厄姆斯顿湖内用实心点标注。坐标点分别是南纬3245′60″东经15147′44″（1点）南纬3244′23″东经15148′31″（2点）南纬3242′41″东经15149′1″（3点）。插图中的实心点表示湖泊在澳大利亚的大概位置。2010年5月，2010年10月，2011年5月，2011年8月进行试验。每一个微观实验持续4天（从第一天的中午12点到第五天的中午十二点）。图表2由图为叶绿素a在不同季节的富营养化微观试验中的浓度，实验时间为2009年4月到2011年8月，氮的实验(N)，磷的实验(P)，氮磷实验(NP)，对照组实验(C)，初始浓度（I）是先于营养实验的第一天测量的。误差线是平均值的标准误差，n=3三个不同营养成分的处理和一组空白试验都在三个不同位置分别作了相同的测试：以KNO3的形式加入500/gL的氮，以KH2PO4的形式加入200/gL的磷，同时加入上述相同浓度浓度的两种物质作为一次单独处理（氮磷处理），选择此营养浓度是为了让初始营养浓度过剩但却未超过澳大利亚淡水系统的预期范围。这次试验在每个点设置了2各货架，每个架台有六个1.25升的聚乙烯瓶放置在水面，以确保充足的光照。货架放置在透光层，在塞克盘深度的一半位置，受到的辐射大约为水表面的25%。在每一点，大约25升水滤过63微米的浮游生物网进入塑料瓶箱中。箱子中装满了塑料瓶，只在上层留了一些空间。加入氮磷培养液从而达到预期浓度，然后塑料瓶装满了上部，并通过旋转而混匀。过滤湖水是为了排除湖水中的浮游动物，因此可以排除浮游动物对浮游植物动力学改变的影响。大于63微米的部分被检测过了，过滤后将蓝藻和其他较大的藻类排除在外。浮游植物，叶绿素a和营养物质浓度的样品采集在第一天和第五天。第一天的样品是从过滤后的箱子中取出并分为三分。浮游植物样品中要加入鲁格试剂，加入营养物质后的浓度需要第一天在替代瓶中测量。需要准备三个相同的替代瓶,氮磷处理的水样也用相同的方法。营养物质样品用0.45微米的滤膜过滤。溶解氧，pH，和温度在第一天和第五天分别在三个位置的瓶中测量。中型富营养化实验原地中型实验是用来检测在富营养化的条件下延长浮游植物的培养时间对其生长所产生的影响。实验从2013年1月17日到2013年2月4日，从2013年3月21日到2013年4月8日。格雷厄姆斯顿位置三的中型实验与之前的微观实验显示的结果一样，浮游植物在这一点的生长速度要高于其他两点，同样这一点的蓝藻含量通常也要高一些。然而位置三是这三个位置中保护的最好的一点。同时，位置三的微观实验的操作过程就是上面所描述的。营养物质的处理与微观实验相同。中型实验是将热封的聚乙烯薄膜放入长2米，宽1.5米的袋子中。一个上端开口，用坚硬塑料管固定的圆柱体（直径1米，长1.5米）附在袋子的顶部和底部。这个中型实验袋附着于三个漂浮的框架（2×2×2米），没一次的营养物质的实验对应一个框架。中型实验大约充满1000升未过滤的湖水。综合第1天，第5天，第9天，第13天，第19天收集的浮游植物，叶绿素a，营养物质浓度的样品。营养物质的样品在第1天添加营养物之前和之后取。溶解氧，pH和温度在中型实验取样时测定。叶绿素a的分析叶绿素a样品在原地用玻璃纤维过滤片进行真空过滤或取样当天带回实验室操作。叶绿素a的分析是根据Gregor&Marsalek的方法，但省略了酸化的步骤。玻璃纤维过滤片用煮沸的90％的乙醇萃取5分钟。利用离心法除去多余的过滤片。立即用VarianCary50BioUV紫外分光光度计测量上清液。浮游植物计数利用SedgwickRafter血球计数板通过显微镜放大200倍观察浮游植物的数量。根据需要在计数前对样品浓缩3.3,5或10倍。参考Prescott,Steble,Krauter和Entwistle等人的鉴别文献将蓝藻和藻类鉴定到属的水平。利用Burch和Olenina等人的最合适的转换因子得出数量最大的藻类属的生物量。营养物质分析营养物质的浓度利用QuikChem8500Lachat营养分析仪进行光度分析。利用抗坏血酸作为还原剂，再加入钼酸盐显蓝色来测量溶解性活性磷的含量。用硝酸盐的含量来代替硝酸盐和氮氧化物的含量（在确定氮氧化物的含量可以忽略后），在镉柱还原后利用对氨基苯环酰胺法测量。数据分析从季节性微观实验中得到的叶绿素a浓度利用SPSSStatistics19.0对其进行二因子方差分析，其显著性水平0.05。Wilk’sLambda利用了Tukey的成对比较法解释了其统计数据，同时其统计数据完成了实验和位置之间的相互交流。利用二因子方差分析和Tukey成对比较法对每个实验浮游植物种属和叶绿素a的数据进行分析。利用Levene统计法对方差同质性进行检测。当然季节性微观实验得到的叶绿素a的数据需要转化为对数形式来满足方差分析。第5天得到的中型实验和微观实验的叶绿素a的数据用二因子方差分析。结论微观富营养化实验富营养化后叶绿素a的变化在这七个试验中至少有一个处理后瓶中叶绿素浓度要高于初