搜索
氮蓝四唑(NBT)法测定超氧化物歧化酶活力一、原理超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)普遍存在于动､植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基𝑂2−的酶，它催化下列反应：2𝑂2−+2𝐻+→H2O2+𝑂2本反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小｡二、材料、仪器设备及试剂(一)材料海滨锦葵叶片｡(二)仪器设备高速台式离心机，分光光度计，微量进样器，荧光灯(反应试管处照度为4000lx)，试管或指形管数支｡(三)试剂(1)0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)｡(2)130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml｡(3)750µmol/L氮蓝四唑溶液称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存｡(4)100µmol/LEDTA-Na2溶液称取0.03721gEDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml｡(5)20µmol/L核黄素溶液称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存｡三、实验步骤1、酶液提取取一定部位的植物叶片(视需要定，去叶脉)0.5g于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml｡取1.5-2ml于4000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。2、显色反应取5ml指形管(要求透明度好)4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下表加入各种溶液:各溶液显色反应用量：[当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表中各试剂（酶和核黄素除外）按比例混合后每支试管一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，但终浓度不变。]试剂名称用量（mL）终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750µmol/LNBT溶液0.375µmol/L100µmol/LEDTA-Na2溶液0.310µmol/L20µmol/L核黄素溶液0.32.0µmol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于4000lx日光下反应20min(要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长)｡3、SOD活性测定至反应结束后，以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的吸光度｡四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性：SOD总活性(U/g)=(𝐴𝐶𝐾−𝐴𝐸)×𝑉12×𝐴𝐶𝐾×𝑊×𝑉𝑡式中：SOD总活性以每克样品鲜质量的酶单位表示(U/g)；ACK为照光对照管的吸光度;AE为样品管的吸光度;V为样品液总体积(ml)；Vt为测定时样品用量(ml);W为样鲜重(g)｡注意事项1.核黄素产生𝑂2−，NBT还原为蓝色的化合物都与光密切相关，因此，测定时要严格控制光照的强度和时间。2.植物中的酚类对测定有干扰，制备粗酶液时可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，尽可能除去植物组织中的酚类等次生代谢物质。3.测定SOD活性时加入的酶量，以能抑制反应的50%为佳。