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-1-50种中药对温和气单胞菌的体外抑菌试验专业：XXXXXXXXXX学号：XXXXXX姓名：XXXXXXXXX指导教师：XXXXXXX摘要：用琼脂扩散法(打孔法)测定了鸡血藤等50种中药对温和气单胞菌(Aeromonassobria)的抑制作用，并用二倍稀释法测定有较强抑菌效果的26种中药对温和气单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果显示∶大部分中药对温和气单胞菌有抑制作用，木瓜和玫瑰花的抑杀效果最好，其抑菌圈直径达20mm以上，其中木瓜的MIC和MBC相同，为7.81mg/ml，玫瑰花的MIC为7.81mg/ml，MBC为15.63mg/ml；儿茶、白芍等5种中药有中等强度的抑菌和杀菌效果;薄荷、远志等4种中药的抑菌强度弱;而柴胡、茵陈等39种中药无抑菌作用。关键词：温和气单胞菌；中药；免疫防治；MIC；MBC温和气单胞菌(Aeromonassobria)，又称威隆气单胞菌(A．Veronii)，属于弧菌科（Vibrionaceae）气单胞菌属，广泛生活于海水、淡水、污水、土壤中，营腐生，能引起水生生物腹泻、败血症等疾病，是危害我国淡水养殖业的重要病原菌之一。同时也能引起爬行类、两栖类等冷血动物的出血性败血症[1,2]。同时，该菌也是重要的人畜共患病的病原菌，能引发腹泻、伤口感染和败血症等症状[3]。传统治疗细菌性疾病的最常用药物是抗生素和合成抗菌药，但其会产生耐药性、药物残留等缺陷，同时国际上对抗生素在水产养殖中的使用也开始有所限制。由于水产养殖中抗生素的使用缺陷及其受到的限制，探讨中药对各种致病菌的抑制作用及其机制变得越来越重要[4]。与抗生素相比，中药在动物体内不蓄积、无残留，而且，由于中药成分复杂，病原微生物不易对中药产生耐药性，提高了其抗菌效力[5]。中药是天然药物，具有毒性低、易降解、安全环保等特点，含抑菌物质，可有效抑制细菌生长[6]甚至杀死细菌,有些中药还具有免疫增强作用，使得中药在水产养殖动物的防治抗病方面展现出越来越广阔的前景[4]。由于不同的中药对不同的细菌的抑制作用不同，同种中药的不同浓度对同种细菌的抑制作用也不同，所以需要进行试验筛选出抑菌作用最强的中草药，以便为生产实践提供依据。本次试验广泛选取了50种中药对温和气单胞菌进行体外抑菌试验，以期为实际生产中由温和气单胞菌引发的常见疾病的防治提供参考。-2-1温和气单胞菌对渔业的危害近几十年来，我国淡水养殖业发展很快，尤其是特种的水产发展，随之而来的疾病给淡水养殖业带来巨大的经济损失[6-9]。而在淡水养殖病害中，温和气单胞菌占有重要位置，致病力甚至强于嗜水气单胞菌[10]。淡水鱼类的细菌性败血症也被称为细菌性出血症、出血症、出血性腹水病、腹水病等，该病是我国水产养殖历史上危害鱼类多，受害鱼类规格范围大，流行区域广、季节长，造成的经济损失大的一种急性传染病。病症主要表现为，发病初期，病鱼的上下颌、口腔、鳃盖、体侧和鳍条基部轻度充血，肠内有少量食物。发病严重时，病鱼体表充血严重甚至出血，眼眶周围发红充血而出现突眼现象，全身肌肉充血呈红色。肛门红肿，腹部膨大，腹腔内有淡黄色透明或是血红色浑浊的腹水，肝、脾、肾肿胀，肠膜及肠壁充血，空肠，肠内充气且有大量粘液，部分鱼鳃器官色浅，呈贫血症状。主要发病在一冬龄的鱼种和成鱼；流行水温以28-32℃为高峰，6-7月份易急性暴发。严重时其发病率高达100％，死亡率可达90％以上。苏应兵等人从表现出血症状的患病斑点叉尾鮰体内分离出病菌，测定结果显示致其急性死亡的致病菌为温和气单胞菌。张晓君等人从患细菌性烂鳃病的草鱼体内分离出了温和气单胞菌和豚鼠气单胞菌，其中温和气单胞菌占占主导地位[15]。同时，随着养鳖业规模的扩大及集约化养殖的普及，鳖病的发生率越来越高，危害日益递增，其中以气单胞菌引起的危害最为严重，能引起鳖的赤斑、红脖子、出血性肠坏死、穿孔、腐皮、疖疮、白点等多种病症，导致的死亡率高达80％，严重制约养鳖业的顺利发展[10-12]。2温和气单胞菌的防治2.1中药防治2.1.1防治优势随着水产养殖业的迅速发展，病原菌的抗药性尤其是多重耐药性日益严重，导致临床上使用的抗菌药物难以达到治疗疾病的目的，给水产养殖业带来不同程度的损失。使用抗菌中药及其制剂来防治鱼类细菌性疾病是一个比较理想的手段。中药是天然绿色植物，作为我国特有的中医理论与实践的产物，以扶正祛邪、标本兼治著称，兼有营养和药用双重作用，可以有效抑制甚至杀灭细菌同时增强机体免疫力，还能促进营养物质消化吸收，此外值得一提的是，中药在机体内无残留，不会使致病菌产生耐药性。孙红祥等人报道的由多味中药材加工研制而成的复方制剂鳖保宁，对鳖病害有显著-3-防治疗效。体外抑菌试验结果表明，鳖保宁及其相关单味药对养殖鳖主要病原菌温和气单胞菌有一定的抑制和杀灭作用。其中，鳖保宁的作用最强，明显高于单味药[10]。2.1.2有效成分及防治机理中药对细菌之所以有抑菌作用是由于其内含有某些抑菌成分，主要包括生物碱类、甙类、挥发油类、鞣质、黄酮类、油脂类、树脂、有机酸、色素、氨基酸、多糖类以及萜类等。如玫瑰花含有多酚类、黄铜类多种化学成分[19-20]。这些化学成分有减少和消除自由基、抗氧化活性、抗血栓、抗癌、抗炎、抑菌、降血脂、免疫调节作用[21-22]。木瓜果实主要含有黄酮类、有机酸类、三萜类、皂角类、糖类、酚类、鞣质等[23-24]。这些化学物质有抗凝血、抑感染、御放射、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老等作用[25]。其中鞣质类特别具有收敛作用，能使皮肤黏膜、溃疡等局部蛋白质凝固；能加速血液凝固而达到止血的目的；能沉淀生物碱，对生物碱中毒有解毒作用。黄酮类具有消除活性氧自由基，防止生物膜脂质被超氧自由基和羟自由基氧化的功能，在抗氧化、抗癌、放肿瘤方面有明显作用。萜类化合物具有消炎、清除自由基、抗突变、抑菌、抗肿瘤、增强免疫力、降转氨酶、纠正体内异常蛋白代谢、防止肝硬化、降血脂、降血糖等作用。多糖类具有抗凝血、抑感染、御放射、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老等作用。2.1.3应用前景中药在水产养殖中有防治疾病、增强免疫力、促进生长、提高饲料报酬、提高成活率、促进繁殖、作诱食剂、改善水产品、减少应激、增加动物的耐受力、防霉防腐等作用[16-18]。此外，中药具有标本兼治的特性,这一优势契合了中医所说“药有个性之特长，方有合群之妙用”的精髓。更重要的是，中药治疗水产动物疾病不会引起药物残留和耐药菌株的产生，因而具有广阔的应用前景。2.2其他控制手段温和气单胞菌在水和土壤中广泛分布，主要宿主是冷血动物。故此病的关键是预防，即加强对养殖用水的消毒净化以杀灭病原。故平时要定时清塘；选用健壮亲鱼进行繁殖，并严禁近亲繁殖；加强饲养管理，采用生物、物理、化学、等方法保持优良水质及底质；投喂优质饲料，提高鱼体抗病力；食场周围定期泼洒消毒液进行消毒；加强巡塘工作，每月对鱼进行抽样调查1-2次，发现病情及时进行防治；在该病流行季节，定期用显微镜检测鱼体，杀灭鱼体外寄生虫；发病池用过的工具要进行消毒，病死鱼要及时捞出深埋，不能到处乱扔等。在使用各种药物进行温和气单胞菌病的预防和治疗过程中，我们还应当重视生态养-4-殖。生态养殖不仅能充分利用水体，提高综合效率，而且可以改善养殖水体水质，有效地预防水产病害的发生，从而减少渔药的使用量。另一方面，我们也要加快生物渔药的研制，利用争夺水生病原微生物的栖息条件，破坏病原微生物的繁衍，以及直接吞噬病原微生物或与其进行种间的生存竞争，来达到控制水产病害的目的[13]。3材料与方法3.1材料3.1.1菌株试验用温和气单胞菌为本实验室保存菌株。3.1.2实验药物50种中药(如表1及图1所示)，购于四川省宜宾市老百姓大药房。3.1.3培养基本试验采用pH为7.2-7.4的普通酵母培养基，其液体培养基配方为：蛋白胨10g、酵母5g、氯化钠5g、水1000ml。固体培养基为每100ml液体培养基加入2g琼脂。表1.中药名录Tab.1TestedChineseherbalmedicines中药科名产地药用部位拉丁名鸡血藤艾叶陈皮北豆根玫瑰花薄荷大枣紫苏牡丹皮茯苓远志天冬地黄豆科菊科芸香科防己科蔷薇科唇形科鼠李科唇形科毛茛科多孔菌科远志科百合科玄参科广西四川湖北河北四川四川河南四川四川湖北山西贵州河南藤茎叶橘皮根茎花蕾茎叶果实茎叶根皮白茯苓根块根根MillettiadielsianArtemisiaargyiPericarpiumCitriRhizomaMenispermiRosarugosaHerbaMenthaeFructusJujubaePerillafrutescensCortexMoutanPoriaRadixPolygalaeAsparaguscochinchinensisRehmannia-5-薏仁姜黄牛膝金银花石韦栀子山楂桑叶漏芦降香柴胡决明子石菖蒲大蓟木香玄参何首乌侧柏叶五加皮茵陈鱼腥草泽泻重楼山慈菇银杏叶青黛木通川芎白芍禾本科姜科苋科忍冬科水龙骨科茜草科蔷薇科桑科菊科豆科伞形科豆科天南星科菊科菊科玄参科蓼科柏科五加科菊科三白草科泽泻科百合科兰科银杏科爵床科木通科伞形科毛茛科贵州四川河南四川湖北四川河北四川湖北广东湖北四川四川四川云南四川四川四川吉林四川四川四川云南四川山西福建四川四川安徽成熟种仁根茎根花叶片成熟果实成熟果实叶根心材茎叶成熟种子花、叶根根根块根叶根皮干燥幼苗地上部分块根根茎假鳞茎叶茎、叶果实根茎根SemenCoicisRhizomaCurcumaeAchyranthesbidentataFlosLoniceraeFoliumPyrrosiaeFructusGardeniaeFructusCrataegiFoliumMoriRadixRhaponticiLignumDalbergiaeRootofChneseCatsiatoraAcorusgramineusHerbaseuRadixCommonVladimiriaFigwortRootFallopiamultifloraPlatycladusorientalisCortexAcanthopanacisHerbaArtemisiaeHerbaHouttuyniaeRhizomaAlismatisRhizomaParidisCremastraePseudobulbusFoliumGinkgoIndigoNaturalisCaulisAkebiaeRhizomaLigusticiWhitePaeony-6-白术木瓜穿破石青蒿大青叶威灵仙明党参儿茶菊科蔷薇科桑科菊科十字花科毛茛科伞形科豆科四川四川四川四川四川四川河北湖北根茎木材根茎叶菘蓝叶茎叶根去皮枝叶AtractylodesmacrocephalaChaenomelesspeciosaXylosmacontroversumHerbaArtemisiaeFoliumIsatidisRadixClematidisChangiumsmyrnioidesAcaciacatechu3.2试验方法3.2.1中药提取液制备将供试中药置于60℃恒温干燥箱中烘至恒重，然后各取中药20g，加入200ml蒸馏水浸泡3h，然后加热至沸腾，沸后文火煮30min，滤出煎液，共煎煮3次，每次加水量200ml。合并3次药液过滤，将滤液蒸发浓缩至浓度为1g/ml，用0.5mol/l的NaOH将药液的pH值调至中性附近，倒入EP管中密封放于121℃高温灭菌锅灭菌20min后，置于4℃冰箱中保存备用。3.2.2培养基制备制备液体培养基：取蛋白胨10g、酵母5g、氯化钠5g、水1000ml于锥量杯中置于火上，沸后文火煮至液体不再腾出量杯为止，将液体倒入锥形瓶中密封，121℃高温湿热灭菌20min后，置4℃冰箱中保存待用。固体培养基为每100ml液体培养基加入2g琼脂，制备方法同液体培养基制法。-7-图1中药Fig.1Chineseherbalmedicines3.2.3温和气单胞菌菌液制备将温和气单胞菌菌株划线培养，28℃孵育过夜。取单菌落种于5ml酵母液体培养