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水塔老陈醋大曲中酵母菌的分离鉴定摘要目的：大曲是山西著名品牌水塔老陈醋发酵的主要原料，其富含多种微生物，研究大曲中酵母菌的组成对老陈醋的发酵生产有重要的指导意义。方法：采用传统分离培养方法，即通过富集培养再稀释涂布、分离纯化出21株酵母菌，对其进行形态学观察、镜检，并且扩增和测定了它们的5.8S-ITS、18S、26SD1/D2区序列，从分子水平上对这些菌株进行了分类学鉴定。结果：测序结果与GenBank中已知序列进行比对，鉴定到2株弗比恩酵母，8株扣囊复膜酵母，6株异常威克汉姆酵母，3株葡萄牙棒孢酵母，2株东方伊萨酵母。结论：大曲中含有多种酵母菌，分离培养和分子生物学鉴定了酵母菌的种类，为纯种制曲打下了基础。关键词：大曲，酵母菌，分离，鉴定大曲是我国传统酿造酒和酿造食醋生产中主要的原料。大曲是酒和食醋酿造过程中重要的微生物、酶类、香气物质和香气物质前提的主要来源[1-2]。大曲中含有多种微生物，可起到糖化、发酵、增香的作用，直接或间接地影响酒和醋的风味及口感。然而，大曲采用开放式富集培养，受场地、工具和制曲室环境以及水、空气等多种因素影响，大曲质量难以得到稳定，同时富集式培养使大曲富含多种微生物，包括功能性微生物和无效、有害微生物，难以保证大曲的质量稳定[3]。酵母菌是大曲中主要的功能性微生物之一，影响酒和老陈醋的发酵生产及口感。分离鉴定大曲中酵母菌的组成，成了近几年酒和食醋的研究热点[4-9]。分离鉴定水塔老陈醋大曲中酵母菌的组成，对提高著名品牌水塔老陈醋的产量和质量有很重要的意义。采用富集培养再稀释涂布、分离水塔老陈醋大曲中的酵母菌，之后对其进行形态学观察、镜检，扩增和测定它们的18S、5.8S-ITS、26SD1/D2区序列，从分子水平上对这些菌株进行了分类学鉴定。分子生物学的鉴定方法不仅能够快速的将各种酵母鉴定到属或种,而且鉴定的结果精确度更高。随着数据库中分子信息量的增加,近年来应用分子生物学技术鉴定酵母菌种的研究越来越广泛[10-17]。对酵母菌鉴定最常用的分子系统发育分析方法有18S、5.8S-ITS、26SD1/D2区等。酵母菌核糖体小亚基18SrRNA存在不同保守程度序列的镶嵌现象(从高度保守到半保守区到高可变区)，使得该分子可以用来衡量较远的亲缘关系，也适宜于较近的亲缘关系。这个区域大约有1800bp，含有不同变异率的区段，可以用于种、属或更高等级分类群之间的系统关系研究[10-12]。酵母菌ITS区为核糖体内转录间隔区，位于18SrDNA和26SrDNA之间，包括ITS1和ITS2两个片断，中间包含一个5.8SrDNA片段。ITS区域与rDNA转录区相比具有较高的变异率，对于亲缘关系较近的菌株间的区分是比较有效的。研究表明ITS区域的差异大于1%时就可能代表不同的种，然而对于不同的属而言，情况会有所不同[11-18]。26SrDNA的Dl/D2区域位于大亚基的5'端，序列长度在600bp左右，该段区域具有较高的变异率，可以用于亲缘关系较近的菌株之间的分类研究，目前已经成为酵母鉴定和系统发育分析的重要“标尺”。虽然酵母种内26SD1/D2区碱基差异小于1%的标准已被普遍接受，然而此数值仍是一个试验的经验值[11-13,19-20]。本研究采用传统分离培养和分子生物学相结合，分离鉴定著名品牌山西水塔老陈醋大曲中酵母菌的种类，研究与老陈醋发酵产香等相关菌种，同时也为食醋传统工艺的研究、改造、纯种制曲等提供指导。1材料与方法1.1材料与仪器设备1.1.1样品和主要试剂大曲由山西水塔醋液股份有限公司提供。YPD培养基购自北京博奥星。DreamTaqGreenPCRMasterMix购自Fermentas;LysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR购自宝生物工程有限公司；其它试剂购自北京化工厂。1.1.2仪器设备灭菌锅，无菌工作台，生化培养箱，摇床，分光光度计，荧光显微镜（重庆奥特光学），GeneAmpPCRSystem2720(ABI)，ChampGel凝胶成像分析系统（北京赛智）。1.2方法1.2.1培养基和样品制备1.2.1.1富集培养基酵母粉1%，葡萄糖2%，蛋白陈2%，调pH至4.5培养基灭菌后再加入链霉素（终浓度30ug/ml）、青霉素（终浓度为50ug/ml），孟加拉红0.033mg/mL，以抑制细菌和霉菌生长。1.2.1.2分离培养基YPD培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂粉2%。葡萄糖单独115℃灭菌15min，然后加入培养基中，倒平板。1.2.1.3样品的处理将曲块经过碾压研磨后混匀过40目筛，保藏在4℃冰箱中备用。1.2.2酵母菌的分离将10g曲粉加入100mL无菌水中，在28℃200r/min下摇20min。取菌悬液3mL接种于富集培养基中，培养48h后吸取5mL稀释涂布法分离，28℃培养2d，观察菌落形态，配合镜检菌种细胞形态，2～3次纯化后保存于4℃冰箱中。1.2.3菌种菌落形态和细胞形态鉴定将酵母菌接种于YPD培养基中，培养3d后，观察菌落形态特征和细胞形态。1.2.4酵母菌菌株基因组DNA的制备取菌种，按方法LysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR说明书制备基因组DNA。提取后的基因组DNA作为扩增5.8S-ITS、18S、26SD1/D2区序列的模板。1.2.55.8S-ITS、18S、26S的D1/D2区序列扩增利用通用引物ITS1（引物序列：5'-ACGGGGGGTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（引物序列：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）以菌株总DNA为模版进行5.8S-ITS序列扩增。利用通用引物EF3（引物序列：5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3'）和EF4（引物序列：5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3'）以菌株总DNA为模版进行18S序列扩增。利用通用引物NL-1（引物序列：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL-4（引物序列：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）以菌株总DNA为模版进行26S的D1/D2区扩增。在50µlPCR反应体系中加入16µl水、正向引物和反向引物各2µl、5µl模版、25µlTaqDNA聚合酶Mix。扩增程序：95℃变性5min后，95℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸2min、共35个循环，72℃延伸10min。电泳检测目的条带，扩增产物送北京理化分析测试中心进行测序。1.2.6数据处理将rDNA测序结果输入数据库，使用BLAST程序与数据库中的序列进行比对分析。根据比对结果，找出与数据库同源性最高的已知菌种，推测待定菌株可能的属或种。2结果与分析2.1酵母菌株分离结果和菌种菌落形态、细胞形态鉴定从水塔老陈醋大曲中分离到优势酵母菌共21株。根据菌落形态特征和菌株细胞形态，将菌株进行初步分类，选取具有代表性的10株菌株，分别编号为M10、Q28、M12、Q13、M17、Q10、M25、Q34、Q7、Q12。其菌落形态与细胞形态见图1。图1酵母菌细胞形态显微照片（1000×）和菌落形态Fig.1morphologyunderlightmicroscope(1000×)andColonymorphologyofyeast2.2分子鉴定结果表15.8S-ITS测序比对分析Table15.8S-ITSsequenceanalysisof21yeastspecies菌株5.8S-ITS测序比对分析相似菌株相似度M10、Q28CyberlindnerafabianiistrainBZR42100%M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33Saccharomycopsisfibuligerastrain3-1Y100%M12、Q3WickerhamomycesanomalusstrainSX199%M15、Q13、Q19、Q27PichiaanomalastrainCTSPF5100%M25、Q2、Q34ClavisporalusitaniaeisolateGK1199%Q7、Q12Issatchenkiaorientalisstrainzhuan1.2PichiakudriavzeviicloneSTA197lsu99%99%表218s测序比对分析Table2.18ssequenceanalysisof21yeastspecies菌株18s测序比对分析相似菌株相似度M10、Q28CyberlindnerafabianiistrainNRRLY-1871100%M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33SaccharomycopsisfibuligerastrainNRRLY-238899%M12、M15、Q3、Q13、Q19、Q27WickerhamomycesanomalusstrainTIBx22999%M25、Q2、Q34ClavisporalusitaniaestrainNRRLY-1182799%Q7、Q12CandidaontarioensisstrainBC2APichiakudriavzeviiisolateEM12Issatchenkiaorientalis99%99%99%表326SD1/D2测序比对分析Table3.26SD1/D2sequenceanalysisof21yeastspecies菌株26SD1/D2测序比对分析相似菌株相似度M10、Q28CyberlindnerafabianiistrainBZR4299%M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33Saccharomycopsisfibuligerastrains-5b-2100%M12、M15、Q3、Q13、Q27、Q19WickerhamomycesanomalusstrainXJHFS-1100%M25、Q2、Q34ClavisporalusitaniaestrainIMAU5Y028(G-1)99%Q7、Q12PichiakudriavzeviistrainDMic113897KluyveromycesmarxianusstrainIMAU4Y089(QH27-4)IssatchenkiaorientalisstrainIMAU3Y00599%99%99%根据测序结果，鉴定到2株弗比恩酵母（CyberlindnerafabianiistrainBZR42，M10、Q28），8株扣囊复膜酵母（Saccharomycopsisfibuligerastrains-5b-2，Q6、Q33、Q25、M11、M26、Q10、Q14、M17），6株异常威克汉姆酵母（WickerhamomycesanomalusstrainXJHFS-1，Q3、Q13、Q27、Q19、M15、M12），3株葡萄牙棒孢酵母（ClavisporalusitaniaestrainIMAU5Y028，M25、Q2、Q34），2株东方伊萨酵母（IssatchenkiaorientalisstrainIMAU3Y005，Q7、Q12）。3结论和讨论本研究按照酵母菌的富集分离培养方法分离山西老陈醋大曲中的酵母菌，利用形态学菌落形态和细胞形态初步鉴定为酵母菌。利用通用引物ITS1和ITS4以菌株总DNA为模版进行5.8S-ITS序列扩增，扩增到了酵母菌5.8S-ITS长度为350-650bp。利用通用引物EF3和EF4以菌株总DNA为模版进行18S序列扩增，扩增到酵母菌的18S长度为1500bp左右。利用通用引物NL-1和NL-4以菌株总DNA为模版进行26S的D1/D2区扩增，扩增到酵母菌的26SD1/D2区长度为500-600bp。成功扩增了21株的酵母菌的5.8S-ITS、18S、26S的D1/D2区序列，并进行了测序，测序结果与数据库