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晋城市园林科研所水杉病害病原的培养实验水杉是我国尤其是长江中下游地区重要的城市绿化树种，近年来，我市也引进了大量的水杉树种，但随着种植面积的不断扩大，水杉病虫害也日趋加剧，严重影响了水杉的生长成材和绿化效果。特别是对于抗性较弱的幼年树种直接造成了严重的病害，今年我市水杉园的水杉大部分的叶片从叶尖开始发生干枯变褐，在病健交界处有黄色晕圈，并且发病严重的树木开始干枯落叶。经过初步判断可能为水杉赤枯病，为了进一步证明水杉所得的病为水杉赤枯病，我们对其病叶进行了分离纯化得到引起该病的病原，通过对病原形态特征观察，与以往报道的对比，明确了该病的病原菌。一、光学显微镜下对病叶的观察我们对采集的病叶进行了初步的光学显微镜观察，在病叶中观察到了大量的分生孢子（图1），可以判定水杉病害为病原物侵染病害，不是非侵染性病害。通过镜检可初步判定此分生孢子为链格孢属，有3个以上的横隔，多链生，呈倒棍棒形或近椭圆形。二、病原菌的分离纯化1.组织培养：取新鲜水杉病叶用无菌水清洗晾干后，剪取病健交界处组织，大小约3mm左右，在超净工作台内，用75%的酒精消毒1min，用无菌水冲洗3次，用灭菌的滤纸吸干水分，接种到PDA培养基上，在每皿中央放置4～5块，AB图1.病叶显微镜镜检。A和B为两个不同的视野置于25℃恒温培养箱中培养。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂15g，用蒸馏水定容到1L。结果：可以看到培养3天后菌落边缘为白色，而内侧为黑色（图2）。7天后菌落中已产生大量的分生孢子，即黑色部分（图3）。2.病原菌的纯化（1）分离纯化将培养7天后形成的菌落，用挑针挑取菌落边缘的新鲜菌丝，转到新新鲜图2.培养3天后培养基菌落形态图3.培养7天后培养基菌落形态的PDA培养基上进行纯化培养。通过观察经过纯化培养后的菌落图，可以看到培养基上只长出了一种菌落，已比较纯净，表明此次纯化较成功（图4）。（若纯化没有成功，可继续进行纯化，直至纯化成功）（2）单孢分离：将已纯化培养7天后的菌落，待产孢后向平板中加入灭菌水轻微晃动，进行梯度稀释，至一滴水中含有1～2个分生孢子为最佳。将适宜浓度的孢子悬浮液涂布于水琼脂上，24h后置于显微镜下观察，用接种针含有单孢子的培养基移入新的PDA培养基上。25℃培养7天，长出的菌落即为水杉病原菌的纯培养物。在PDA培养基上，菌落边缘初为白色或淡色，后变为青灰色至黑色。菌落为绒絮状，气生菌丝发达，菌丝有分隔，多分枝。25℃培养3天后，开始产生分生孢子。分生孢子多链生，呈倒棍棒形，或近椭圆形。分生孢子具有3-8个横隔，分隔处不缢缩或微缢缩。三、接种试验为了证明分离纯化的病原菌为引起该病的病原，理论上根据柯赫氏法则要在水杉健康叶子上进行接种。由于本实验时间处理的不恰当，错过了健康水杉叶子的时期，未采集到健康的水杉叶子。不过经过资料查询，发现油松也得赤枯病，图4.培养3天后的菌落形态于是我们将病原接种到健康的油松叶子上，观察其发病情况而进行一项参考。1.接种体的制备：用无菌水将病原菌的孢子悬浮液稀释至一滴水中含有1-2个分生孢子左右。2.接种：将配好的孢子悬浮液用喷瓶对健康的油松叶子进行喷雾，以一小枝为一个处理，放置在覆盖有一层滤纸的培养皿上进行保湿培养（喷雾不可过多，过湿）。对照用无菌水进行喷雾。每天观察接种叶片的发病情况。（至于25℃培养箱中进行培养）发病症状：接种4天后，接种叶片开始出现症状，叶片大部分从叶尖开始发病，叶片开始枯黄坏死。症状同水杉赤枯病的症状很相似（图5）。A接种试验后我们又对发病叶片进行了镜检和病原菌培养，所得的菌落形态特征同水杉分离到的病原菌的菌落形态特征相同。BC图5.接种油松。A为孢子悬浮液喷洒油松后表现的症状B为孢子悬浮液喷洒油松后表现症状局部放大图C为对照四、结论本实验虽然通过病原菌培养和接种、病原菌形态学特征观察鉴定引起水杉叶子发黄发褐的是由链格孢属真菌引起的，表明引起水杉病害的为水杉赤枯病。但由于接种试验未采集到健康的水杉叶子，未按照柯赫氏法则正常进行，并不具有严密的科学性，所以本实验只能做一个参考对比。