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1生活饮用水标准检验方法－微生物指标GB/T5750.12-2006陕西省疾病预防控制中心王安礼手机13088978284办公电话822291052卫生指标菌概念及卫生微生物学检验原则水样的采集、保存与运输要领我国饮用水的微生物学检验及卫生标准GB/T5750.12-2006样品的检验与报告3卫生指标菌及卫生微生物学检验原则指标菌的概念:指标菌（或称指示菌）(indicatorbacteria,orbacterialindicators）是指在常规卫生监测中，用以指示检品卫生状况及安全性的指示性微生物。4卫生指标菌及卫生微生物学检验原则指标菌的选择标准作为一般卫生质量和安全性评价的指标菌，依据不同的样品有不同的目的和要求，总的选择原则是易于检出，检验方法比较简单、方便、有一定的代表性等。简单说就是具有可操作性及可重复性。5卫生指标菌及卫生微生物学检验原则GB5749—2006规定的微生物检验指标共4项常规指标：菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌和2项非常规指标：贾第鞭毛虫和隐孢子虫。6菌落总数（细菌总数）：水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1ml水样所含菌落的总数。水中菌落总数可作为评价水质清洁程度和考核净化效果的指标。卫生指标菌及卫生微生物学检验原则7饮用水卫生标准规定菌落总数限值为每毫升水样不超过100CFU。菌落总数增多说明水样已被污染，但不能说明污染来源，也不能说明该水体传播传染病的风险程度。因此，必须结合总大肠菌群来判断水质污染的来源和安全程度。卫生指标菌及卫生微生物学检验原则8总大肠菌群：指一群在37℃培养24h，能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。一般地说，总大肠菌群能够指示肠道传染病存在的可能性，但它不是专一的指示菌。GB5749-2006《生活饮用水卫生标准》中规定100毫升水样中不得检出总大肠菌群。卫生指标菌及卫生微生物学检验原则9如果在水样中检出总大肠菌群，则应再检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群以证明水体是否已经受到粪便污染；如果水样中没有检出总大肠菌群，就不必再检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群。总大肠菌群是评价饮用水卫生质量的重要微生物指标之一。卫生指标菌及卫生微生物学检验原则10耐热大肠菌群（粪大肠菌群）：是指用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长的大肠菌群。主要来源于人和温血动物粪便，是水质受粪便污染的重要指标菌。检出耐热大肠菌群表明饮水已被粪便污染，有存在肠道致病菌和寄生虫等病原体的危险。新国标规定每100毫升水样中不得检出耐热大肠菌群。卫生指标菌及卫生微生物学检验原则11大肠埃希氏菌（Escheiriquecoli）：在含有荧光底物的培养基上44.5℃培养24h产生β－葡萄糖醛酸酶（β－glucuronidase）,分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征荧光的细菌。卫生指标菌及卫生微生物学检验原则12大肠埃希氏菌是粪便污染最有意义的指示菌。新国标规定：若检出总大肠菌群，须进行大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群检测。若水样中检出大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群，说明水体可能已受到粪便污染，存在发生肠道传染病的可能性，必须采取相应措施。卫生指标菌及卫生微生物学检验原则13水质非常规指标：贾第鞭毛虫和隐孢子虫他们是两种可能存在于水中或其他介质中的原虫类寄生虫。卫生指标菌及卫生微生物学检验原则14水质常规指标及限值指标限值总大肠菌群/（MPN/100ml）或CFU/100ml）不得检出耐热大肠菌群/（MPN/100ml）或CFU/100ml）不得检出大肠埃希氏菌/（MPN/100ml）或CFU/100ml）不得检出菌落总数/（CFU/ml）100水质非常规指标指标限值贾第鞭毛虫（个/10L）＜1隐孢子虫（个/10L）＜115常规指标是指能反映生活饮用水水质基本状况的水质指标，非常规指标是指根据地区、时间或特殊情况需要实施的生活饮用水水质指标。卫生指标菌及卫生微生物学检验原则16新标准初步实现了与国际接轨。同时考虑到地区差异性，其中的“水质非常规指标及限值”的实施项目和日期由各省省级人民政府根据当地实际情况确定，但是最迟于2012年7月1日必须实施。最新情况是：国家要求到2015年全国省会城市106项指标实行全覆盖；在地市级城市覆盖42项常规指标。卫生指标菌及卫生微生物学检验原则17水样的采集、保存、运输要领1、采集水样应该特别注意无菌操作，以防杂菌污染，盛水容器在采样前必须洗刷干净，进行灭菌后备用（水样瓶容量为500ml的磨口玻塞瓶，用纸包裹后灭菌）。18水样的采集、保存、运输要领2、在取自来水水样时，必须用清洁布将水龙头擦干，再用95%酒精烧灼消毒水龙头周围，然后把水龙头完全打开，放水5—10分钟后再将水龙头关小，采集水样。经常取水的水龙头放水1—3分钟后即可采集水样。机井水的采样与自来水相同。19水样的采集、保存、运输要领3、取江、湖、河、水库、蓄水池、游泳池等地面水源的水样时，一般在居民常取水的地点，应先将无菌采样瓶浸入距水面10—15cm水深处，井水在离水面50cm深处，然后掀开瓶塞采集水，待水盛约4/5后将瓶塞放下塞好，从水中取出。20水样的采集、保存、运输要领4、采集经氯处理的水样（如自来水、游泳池水）时，应按每500ml水样加入硫代硫酸钠0.03g或其1.5%水溶液2ml，其目的是作为脱氯剂，以避免剩余氯对水样中细菌的杀灭作用而影响检测结果。21水样的采集、保存、运输要领5、水样采集后，尽快于2小时内送到实验室。如路途较远，应将水样瓶置于6℃—10℃的冰壶内运送，运送时间不得超过6小时，洁净的水最多不超过12小时。22水样的采集、保存、运输要领6、水样送到后，应立即进行检测，如条件不许可，则将水样暂时保存在4℃冰箱中，但是不超过4小时。7、送水样时应避免玻璃瓶摇动，以免水样溢出后又回流瓶中，从而增加污染。8、检验时应将水样摇匀，一般振摇5-10分钟。23饮用水标准检验方法一、菌落总数—平皿计数法；二、总大肠菌群—多管发酵法、滤膜法、酶底物法。三、耐热大肠菌群—多管发酵法、滤膜法；四、大肠埃希氏菌—多管发酵法、滤膜法、酶底物法。五、贾第鞭毛虫、隐孢子虫—免疫磁分离荧光抗体法。24菌落总数检验方法：平板计数法1、以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1ml充分混匀的水样，注入灭菌平皿内，倾注约15ml已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一个平行样，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。2、待冷却凝固后，翻转平皿，底面向上，置于36℃±1℃培养箱内培养48h，进行菌落计数，即为1ml水样中的菌落总数。25菌落总数检验方法：平板计数法平皿内琼脂凝固后，不要长久放置才翻转培养，而应于琼脂凝固后，在数分钟内将平皿翻转进行培养，这样可避免菌落蔓延生长。26菌落总数检验方法：平板计数法菌落计数时，应先分别观察同一稀释度的2个平板和不同稀释度的2个平板内菌落的生长情况。平行检样的2个平板上生长的菌落数应该接近,不同稀释度的几个平板上的菌落数应与检样倍数成反比，即检样稀释倍数越大,菌落数越少，稀释倍数越小，菌落数越多。27菌落总数检验方法：平板计数法如果稀释度大的平板上菌落数反而比稀释度小的平板上菌落数多，则可能是检验工作中存在的差错，应查明原因，予以纠正。28菌落总数检验方法：平板计数法若平板上出现链状菌落，而且菌落之间没有明显的界限，则一条链作为一个菌落；如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可计”报告结果，而应在稀释度最大的平板上，任意数其中2cm2内的菌落数，除2求出每cm2内平均菌落数，乘以皿底面积，即π×r2。29菌落总数检验方法：平板计数法例如：10-1—10-3稀释度所有平板上均菌落密布，就在10-3稀释度的平板上任意数2个cm2内菌落数是60个，皿底直径为9cm，则该检样每ml中“估计“菌落数为(60/2)×(3.14×4.52)×1000=1908000或1.9×106；30总大肠菌群检验步骤：最常用：多管发酵法（三步法）总大肠菌群检验步骤：乳糖初发酵试验平板分离培养证实试验（MPN值报告结果）31总大肠菌群检验步骤：（多管发酵法）稀释度的选择：对检样特别是不了解其污染情况的样品，则必须考虑其污染程度来选择合适的稀释度。对低污染样品，选择10、1、和0.1ml3个稀释度，如果污染较严重，相应稀释度就应大些，如1、0.1、0.01ml或更大。在无法估计其细菌污染量时，可多做几个稀释度，待结果出来后，可根据MPN表酌情选择。32总大肠菌群检验步骤：（多管发酵法）1、乳糖发酵试验：取10ml水样，接种到10ml双倍乳糖蛋白胨培养液中，取1ml水样，接种到10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1ml水样注入到9ml灭菌生理盐水中，换一支吸管，混匀后吸取1ml（即0.1ml水样）注入到10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。33总大肠菌群检验步骤：（多管发酵法）对已处理过的出厂自来水需经常检验或每天检验一次的，可直接接种10ml水样到10ml双料培养基中，共接种5份。34总大肠菌检验步骤：（多管发酵法）将接种管置36℃±1℃培养箱内，培养24h±2h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产酸产气，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按以下步骤进行。35总大肠菌检验步骤：（多管发酵法）2、分离培养：将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃±1℃培养箱内培养18h--24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色，镜检和证实试验。①深紫黑色，具有金属光泽的菌落；②紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；③淡紫色、中心较深的菌落。36总大肠菌检验步骤：（多管发酵法）3、证实试验：经上述染色镜检为G¯无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36℃±1℃培养箱中培养24h±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。4、结果报告：根据证实为总大肠菌群阳性管数，查MPN值表。报告每100ml水样中的总大肠菌群最可能数。稀释样品查表后所得结果应乘稀释倍数。37总大肠菌检验步骤：（多管发酵法）注意事项：挑选菌落与大肠菌群的检出率有密切关系，在实际工作中，往往为了节省人力和时间，通常只挑取一个菌落，由于概率的问题，很难避免假阴性的出现。所以挑选菌落时一定要挑取典型菌落，如无典型菌落时应多挑几个，以免出现假阴性。38总大肠菌检验步骤：（多管发酵法）除典型的大肠菌群菌落外，特别注意对非典型大肠菌群菌落的鉴别，这些菌落往往无金属光泽、色淡、也要进行革兰染色镜检，并接种乳糖蛋白胨培养基。证实为革兰氏阴性无芽孢杆菌并能发酵乳糖产酸产气者，则仍判定为大肠菌群阳性。39耐热大肠菌群检验步骤：（多管发酵法）自总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管（产酸产气）中取1滴转种于EC培养基中，置44.5℃±0.5℃水浴箱或隔水式恒温培养箱内（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面），培养24h±2h，如所有管均不产气，则可报告为阴性，如有产气者，则转种于伊红美兰琼脂平板上，置44.5℃±0.5℃培养18h--24h，凡平板上有典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群阳性。40大肠埃希氏菌检验步骤：（多管发酵法）将总大肠菌群多管发酵初发酵产酸产气的阳性管进行大肠埃希氏菌检测。1，接种：用烧灼灭菌的金属接种环或灭菌棉签将上述试管中液体接种到EC-MUG管中。2，培养：将已接种的EC-MUG管在培养箱或恒温水浴箱中44.5℃±0.5℃培养24h±2h。如使用恒温水浴，在接种后30min内进行培养，使水浴箱的液面超过EC-MUG管的液面。413、结果观察与报告：将培养后的EC-MUG管在暗处用波长为366nm功率为6W的紫外光灯照射，如果有兰色荧光产生则表示水样中含有大肠埃希氏菌。计算EC-MUG阳性管数，查对应的最可能数（MPN）表得出大肠埃希氏菌的最可能数，结果以MPN/100ml报告。大肠埃希氏菌检验