汞胁迫对桐花树幼苗根和叶蛋白质功能的影响

汞胁迫对桐花树幼苗根和叶蛋白质功能的影响设计方案目录：1.研究现状2.研究目标3.研究方案3.1基本生理指标的测定3.1.1丙二醛（MDA）的测定3.1.2还原糖的测定3.1.3叶绿素的测定3.1.4谷胱甘肽（GSH）的测定3.1.5过氧化物酶（POD）的测定3.1.6超氧化物歧化酶（SOD）的测定3.1.7过氧化氢酶（CAT）的测定3.1.8总汞的测定3.2蛋白质指标的测定3.2.1超薄切片制作及电镜观察3.2.2可溶性蛋白含量测定3.2.3蛋白的层析分析3.2.4非蛋白巯基（non-proteinthiol，NPT）含量的测定3.2.5细胞可溶部分Hg的分子分布4.经费预算参考文献1.研究现状红树林是指自然分布于热带亚热带海陆交汇的潮间带木本植物群落，是海滩上特有的森林类型,红树植物是该生态系统各级消费者物质和能量的主要来源，对维护生态平衡，保护海岸生态系统起着重要的作用(林鹏等，1995；林鹏，1997)。红树植物是热带、亚热带海湾河口优势植物种,是该生态系统的重要初级生产者,对维护海湾河口地区的生态平衡起着十分重要的作用。近年来，随着江河流域工农业的发展，沿海城市人口与经济的增长，大量排放的污染物汇集于河口、海湾区，从而使重金属污染日趋严重。汞是一种极毒的重金属元素,其毒性位于各金属之首。汞分为无机汞和有机汞两大类,后者的毒性比前者更大。当植物体中汞的积累浓度达到一定范围后,它就会破坏细胞的结构（解凯彬等，2000；李大辉等，1999；施国新等，2000；郝怀庆，2001），轻则使植物体内代谢过程发生紊乱,生长发育受阻,重则可造成植物枯萎,甚至衰老死亡（张义贤，1997）。由于它极易经大气、水源和土壤进入植物体内,然后再通过食物链进入动物和人体中,对其造成极大的毒危害,有的甚至能引起人的神经系统出现严重缺陷,表现出强烈的致畸、致癌和致突变活性。桐花树（Aegicerascorniculatum）是具有一定的耐盐和泌盐性红树植物，也是我国分布最广的红树树种之一（高桂娟等，2009）。本文以红树植物桐花为材料，观察其在不同Hg浓度胁迫下的生理生态变化，以及叶、根细胞中蛋白质的适应性变化，为揭示红树植物的耐Hg机制提供一些理论和实践依据。2.研究目标红树林作为一种海岸潮间带森林生态系统,对海湾河口区域的污染具有较高承载力和耐受性。目前，在红树植物对重金属污染响应方面的研究主要集中于红树植物对重金属的富集以及生长、形态和生理学方面,对红树植物抗污染胁迫的分子机理方面的研究还极少有报道。分子生物学和生态学原理的结合,为污染生态学的研究开辟了一个广阔的研究领域（李裕红，章幼玉，2007）。本实验以红树植物桐花为材料，观察其在不同Hg浓度胁迫下的生理生态变化，以及叶、根细胞中蛋白质的适应性变化，为解释红树植物的耐Hg机制提供一些理论和实践依据。在蛋白质水平探讨红树植物对重金属具较高耐受性的分子生态机理,可能发现在红树植物中普遍存在的高效的重金属结合物质及其控制基因,可为汞污染的植物生理学监测提供理论基础，也可为研究红树植物抗重金属污染机制及红树林生态环境的保护提供科学依据和实践依据。3.研究方案挑选当年生株高约20~30cm，4~5对叶片，且生活力强，无病虫害，大小相近的桐花树（Aegicerascorniculatum）幼苗进行试验。首先进行水培，加1/4Hogland营养液于实验室外自然光下复壮一周（室温约25℃），准备实验。复壮后，幼苗用自来水冲洗干净并用超纯水冲洗3遍后进行不同浓度的Hg（0、0.2、1、10、50ppm）胁迫处理，胁迫液为HgCl2溶液和1/4Hogland营养液的混合液。每处理3个重复，每重复5~6株幼苗。5天后分别取5种胁迫浓度的秋茄幼苗进行实验。3.1基本生理指标的测定3.1.1丙二醛（MDA）的测定采用硫代巴比妥酸法测定秋茄叶片和根的MDA含量。参照赵世杰等方法，选取新鲜成熟叶，去除中脉剪碎混匀称取0.5g样品，加入3mL10％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆移至15mL离心管；再加入2mL10％TCA将研钵中的残渣洗入离心管。匀浆在4000r/min离心10min。测定：取上清液2mL（对照组2mLH2O）于新的15mL离心管中，加入2mL0.6%TBA（用10%三氯乙酸配制）混匀，离心管盖子拧紧。混合物于沸水浴中沸煮15min，迅速冷却后在4000rpm，4℃，离心20min。取上清液测定OD532、OD450。计算：提取液中MDA的含量C(umol/L)=6.45OD532-0.56OD450然后计算每克样品中MDA含量3.1.2还原糖的测定采用蒽酮比色法（李合生，2000）测定秋茄叶片的可溶性糖含量。称取干样0.0500～0.1000g(0.0500~0.0700g），分别加入15mL刻度离心管中；加蒸馏水10mL，置沸水浴中提取30min，冷却离心，上清液倒入50mLPE瓶中，再往离心管中加10mL蒸馏水，置沸水浴第二次浸提，上清液倒入PE瓶中，向瓶中加入蒸馏水至50mL左右，称重。吸取测定液0.5mL于大试管中，加蒸馏水摇匀，加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯，放入波长630nm的分光光度计中比色。结果计算：可溶性糖％＝测定液糖含量(μg)×10-6/干样重(g)×分取倍数×100％3.1.3叶绿素的测定参照张宪政（张宪政，1986）的乙醇-丙酮混合液法略有改进。选取新鲜成熟叶片，去除中脉剪碎混匀称取0.1～0.2g叶片。等体积乙醇、丙酮混合液10mL浸泡（乙醇：丙酮：水=4.5：4.5：1），并用保鲜膜封口防止提取液挥发，置于阴暗处并定期震荡。浸泡至组织变白后，使用紫外分光光度计分别于波长663nm、645nm处测定其抽提液的OD值。根据以下公式计算叶绿素含量：Ca=12.7×OD663－2.69×OD645(2.1)Cb=22.9×OD645－4.86×OD663(2.2)Ca+b=8.02×OD663+20.20×OD645(2.3)叶绿体色素的含量=样品鲜重（或干重）稀释倍数提取液体积色素的浓度（mg/g）（C为叶绿素浓度，以μg/mL表示）3.1.4谷胱甘肽（GSH）的测定（1）谷胱甘肽标准曲线的制作取6支试管编号，按下表加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。以0号管为参比调零，测定显色液在波长412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量为横坐标，绘制标准曲线。表1谷胱甘肽标准曲线制作时各试剂加入量试管号100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液/ml蒸馏水/mL0.1mol/LPH7.7磷酸缓冲液0.1mol/LPH7.7磷酸缓冲液相当于还原型谷胱甘肽物质的量/μmol001.01.00.5010.20.81.00.52020.40.61.00.54030.60.41.00.56040.80.21.00.58051.001.00.5100（2）提取称取1g样品于研钵中，加入5mL经4℃预冷的50g/L三氯乙酸溶液（含5mmol/LNa2-EDTA），在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、19000g离心15min（15mL离心管）。收集上清液用来测定谷胱甘肽含量，测量提取液总体积（V？）（3）谷胱甘肽的测定GSH测定液的制备：将液氮固定的鲜样组织放于研钵中，加入一定量的0.1mol/L磷酸钠缓冲液（含0.005mol/LEDTA）（PH8.0）和25%偏磷酸（HPO3），并加少量石英砂，冰浴上充分研磨，冷冻离心（4℃，18000g15min），上清液冷藏用于GSH的测定。GSH测定采用荧光分光光度法，参照Gupta等和Hissin等的方法（？）。测定：取1支5mL离心管，依次加入1mL蒸馏水、1mL0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.7）和0.5mL4mmol/LDNTB溶液，混匀，即为绘制标准曲线的0号管液。以此溶液作为参比，在波长412nm处对分光光度计进行调零。另取2支试管，分别加入1mL（Vs）上清液、1mlL0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.7）。向一支试管中加入0.5mL4mmol/LDNTB溶液，另一支试管加入0.5mL0.1mol/L磷酸缓冲液（PH6.8）。将两支反应管置于25℃保温10min。按照标准曲线的方法，迅速测定显色液在波长412nm处的吸光度，分别记做ODS和ODC。（4）结果计算显色反应后，分别记录样品管反应混合液的吸光度（ODS）和空白对照管反应混合液的吸光度（ODC）。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量（n），计算其含量（μmol/g）。还原性谷胱甘肽含量（μmol/g）=（n×V）/（Vs×m）其中：m为样品质量3.1.5过氧化物酶（POD）的测定（1）原理：采用愈创木酚法（刘祖祺，张石城,1994？）测定POD过氧化物酶。以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）。POD活性=△A470×1000/P×V×0.01[u/mgPro]（2.7)其中：△A470----1min内吸光度的变化；P----蛋白浓度，μg/mL；V----取用酶液体积，mL。（2）试剂：反应混合液：100mmol/L磷酸缓冲液（PH6.0）50mL，加入愈创木酚28mL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19mL，混合均匀，保存于冰箱中。（3）试验步骤：粗酶液提取：称植物叶片0.5g于研钵中分次加入0.05mol/L预冷的磷酸缓冲液5mL以及少量（1mL）的PVP（聚乙烯吡咯烷酮），在冰浴下，研磨成匀浆，转移至15mL离心管中，再用4ml缓冲液清洗研钵中的残渣。匀浆在高速冷冻离心机上4℃19000或4000r/min（最大离心率）离心10min,收集的酶液用于活性测定。（提取的酶液即为10mL）酶活性的测定：取光径1cm比色皿2只，于一只中加入反应混合液3.9mL，KH2PO40.1mL，作为校零对照，另一只中加入反应混合液3.9mL，酶液0.1mL，立即开启秒表计时，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次。以每分钟OD变化值表示酶活性大小。3.1.6超氧化物歧化酶（SOD）的测定（1）原理：采用氮蓝四唑（NBT）法（李合生,2000）测定SOD超氧化物歧化酶。已知SOD活性单位以抑制NBT光化学还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD活性=2（ACK-AE）×V/ACK×W×Vt(2.5)；SOD比活力=SOD活性/蛋白质含量(2.6)其中：ACK---照光对照管的吸光度；AE----样品管的吸光度；V----样品液的总体积，mL；Vt----测定时样品用量，mL；W----样品鲜重，g。SOD活性单位U/gFW，蛋白质含量单位为mg/g，SOD比活力单位为U/mg蛋白。（2）试剂：0.05mol/L磷酸缓冲液（PH7.8）130mmol/L甲硫酸铵（Met）溶液：称取1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100mL750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。④100μmol/LEDTA-Na2溶液：称取0.03721gEDTA-Na2（乙二胺四乙酸二钠），用磷酸缓冲液定容至1000mL⑤20μmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000mL避光保存。（3）仪器：高速台式离心机，分光光度计，荧光灯（反应试管处照度为4000lx）（4）具体步骤：①酶液提取：称植物叶片0.5g于研钵中分次加入0.05mol/L预冷的磷酸缓冲液5mL以及少量（1mL1%）的PVP，在冰浴下研磨成匀浆，转移至15mL离心管中，再用4mL缓冲液清洗研钵中的残渣。匀浆在高速冷冻离心机上4℃19000r/min离心10min,收集的酶液用于活性测定。（提取酶液即为10mL）②显色反应：取5mL透明度好的指形管4支，2支为测定管，2支为对照管，按下表加入各溶液。混匀后，将1支对照管放置在暗处，其它各管于4000lx日光下反应20min。③SOD活性测定