液相芯片技术在检验医学和生物医学中的应用WPS

©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.·综述·中国生物化学与分子生物学报ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology2007年4月23(4):256～261液相芯片技术在检验医学和生物医学中的应用杨洋,汤华3(天津医科大学生命科学中心,天津300070)摘要液相芯片技术是以100种不同荧光编码的微球作为探针的载体,生物分子间的反应在悬浮液态体系中进行的一类新的生物芯片技术.在这个灵活和开放的平台中可进行蛋白质、核酸等生物大分子的检测.液相芯片较传统的固相芯片的优势在于检测准确、信息质量稳定、可重复性好.液相芯片以其易于操作、高通量、高灵敏度、高准确度、高精密度以及宽的线性测定范围的特点,逐渐进入了临床诊断领域.关键词液相芯片;蛋白质芯片;基因芯片;生物芯片中图分类号R331ApplicationofLiquichipinLaboratoryMedicineandBiomedicalResearchYANGYang,TANGHua3(TianjinLifeSeicencResearchCenter,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China)AbstractLiquichipisanewtypeofbiochipwith100differentkindsoffluorescentbeadsascarriersofdifferentprobesandthereactionofbiomoleculesisfinishedinsuspensefulliquidsystem.Itisaflexibletechnicalplatform,whichisusedforprotein2analysis,nucleicacidanalysisandsoon.Comparedwithtraditionalbiochip,theadvantagesofliquichipareaccuracy,reliableandhighreproducibility.Ithasthecharacteristicsoftheeasyoperation,thehigh2throughput,thehigh2sensitivity,thehigh2accuracy,thehighprecisionandthegreatdynamicrange.Itisbeingappliedinthefieldofclinicaldiagnose.Keywordsliquichip;proteinchip;genechip;biochip生物芯片是20世纪90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一,是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的尖端新技术,与微电子芯片一起并称为20世纪最伟大的两大发明.生物芯片是以某种特定的支持物为载体,在单位面积上高密度地排列大量的生物捕获分子(核酸探针、抗体、抗原等),从而达到一次试验同时检测多种疾病或分析多种生物成分的目的1.生物芯片在疾病的检测方面具有独特的优势,仅需极少量的样品,在极短时间内,可以同时检测多种疾病或一种疾病的多个指标,向医务人员提供大量的疾病诊断信息,从而帮助医生在短时间内找到正确的治疗措施2.生物芯片根据其反应体系状态的不同,可分为固相芯片和液相芯片,根据检测对象的不同又可分为基因芯片和蛋白芯片.传统的固相生物芯片存在操作繁琐、信息质量的稳定性和可重复性差的致命弱点,极大地限制了生物芯片在医学诊断领域的临床应用.液相芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的被喻为后基因组时代的芯片技术,也可称为灵活的多种被分析物质的检测(flexiblemulti2analyteprofiling,xMAP)技术,xMAP技术是集流式技术、荧光微球、激光、数字信号处理和传统化学技术为一体的一种新型生物分子高通量检测技术,这种技术将流式检测与芯片技术有机地结合在一起,使生物芯片反应体系由液相2固相反应改变为接近生物系统内部环境的完全液相反应体系,因此也被称为液相芯片技术.它的特点是一个灵活的、开放的技术平台,根据待检测生物分子的不同,xMAP技术可以根据需要进行相应的构建,从而可以对不同的生物分子进行快速、廉价、准确的检测.2005年11月,为了表彰其对临床诊断技术进步做出的革命性贡献,全收稿日期:2006209225,接受日期:20062122283联系人Tel:022225542503,E2mail:[e-mail]:September25,2006;Accepted:December28,20063CorrespondingauthorTel:022225542503E2mail:[e-mail]©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.期杨洋等:液相芯片技术在检验医学和生物医学中的应用257球科技产业和行业研究的权威机构———Frost&Sullivan,授予xMAP技术“2005年度国际临床诊断技术革新大奖”,标志着xMAP技术在国际临床诊断技术领域的领军地位得到了最具权威的认可.迄今为止,不到10年时间,全球已有数百套基于此项技术的检测平台,用于蛋白质免疫学等领域的研究,临床诊断试剂的开发方面也发展相当快,自身免疫鉴别诊断试剂等已通过了美国食品药品管理局(FDA)认证.目前,全球有两大厂商为用户提供这个检测平台,分别为美国luminex公司制造,名为luminex系列的产品,以及由荷兰控股的QIAGEN跨国公司生产,名为BioRobotLiquichip的产品.1液相芯片的检测原理液相芯片体系由多种不同的小球体组成,目前这些小球体都是由染有荧光染料的聚苯乙烯构成,直径大小为10nm～1000μm之间,其中以直径为516μm的最为常见.根据荧光染料的比例不同,可将这些微球分为100种.根据这些荧光小球体表面基团的不同,可分为表面带有亲合素的荧光微球、表面带有组氨酸标签的荧光微球、表面带有羧基基团的荧光微球,这些荧光微球通过表面的特定基团可以交联相应的探针.荧光微球表面带有羧基基团的微球在检测分析中最为常用,下面主要以表面带有羧基基团的荧光微球介绍液相芯片的检测原理.荧光微球表面的羧基基团经活化后,可以与需要交联的蛋白质探针的氨基基团形成共价键,也可以与需要交联的经氨基化修饰的核酸探针形成共价键.这样不同荧光编码的微球可以根据需要交联上不同的探针分子,利用这100种由不同荧光信号编码的微球,最多可以交联有100种不同的探针,将这些小球体悬浮于一个液相体系中,与待检分子反应充分后,再加入合适的报告分子,就构成了一个液相芯片的反应系统.液相芯片的检测系统内置两束波长不同的激光发射器,一束激光用来激发荧光微球的自身荧光物质,根据探测到的荧光微球自身发出的荧光强度来决定探针分子的特异性(定性);另一束激光用来激发报告分子所携带的荧光物质,通过对报告分子发出荧光强度的测量,对待检生物分子进行定量或半定量.利用这个技术系统,我们可以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行检测,这种检测技术我们称之为xMAP技术.111大分子蛋白的检测原理大分子蛋白由于具有多个不同的抗原决定表位,因此可以制备出针对这一大分子蛋白的两个不同抗原决定表位的配对抗体,如Fig.1所示,检测原理类似免疫学上的双抗体夹心法.首先在一种荧光微球表面交联抗待检蛋白的一种抗体,然后加入待检蛋白分子,经过一定时间反应后,加入标记有生物素的另一配对抗体,反应一定时间后,再加入标记有藻红蛋白(PE)的链亲合素,经过一定时间的反应,在532nm波长的激光激发下,可检测出报告分子PE发出的荧光强度,报告分子荧光强度与待检蛋白含量成正比,因此,可对待检蛋白进行定量检测.Fig.1Thewayoflargemoleculeproteinassay112小分子蛋白的检测原理小分子蛋白由于分子量少,蛋白的抗原决定表位有限,甚至只有1个,不适合类似双抗体夹心法的检测.如Fig.2所示,可采用免疫竞争法的检测原理,即在一种荧光微球表面交联上这种小分子蛋白纯品,同时加入待检的游离的小分子蛋白和其标记有生物素的相应抗体,这样待检的游离的小分子蛋白就会和交联在微球表面的小分子蛋白纯品竞争结合抗体,经过洗脱后加入PE标记的链亲合素,在532nm波长的激光的激发下,可检测出报告分子发出的荧光强度,荧光强度与待检的小分子蛋白的量成反比,因此,可以对待检小分子蛋白进行定量检测.©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.核酸分子的检测原理首先对核酸探针进行氨基化修饰,核酸探针分子上的氨基可与荧光微球表面活化的羧基形成共价键,从而交联在荧光微球表面.待检核酸分子在通过聚合酶链反应(PCR)扩增过程中可做适当的生物素标记.如Fig.3所示,将经PCR扩增后的待检核酸分子与交联在微球表面上的相应探针进行杂交反应后,加入PE标记的链亲合素经过一定时间的反应后,可通过PE发出的荧光强度对待检核酸分子进行半定量.Fig.3Thewayofnucleicacidanalysis2液相芯片的应用液相芯片技术自问世以来,已广泛应用于各种领域,如基因检测、细胞因子检测、蛋白质分析,还可应用于药物检测等,这极大的推动了临床检测和科学研究的快速发展.211在激素检测中的应用Bellisario等3用液相芯片技术,在对新生儿甲状腺功能的检测中,成功的在新生儿干燥的血斑标本中,同时检测并定量了游离甲状腺素4(T4)和促甲状腺素(TSH),并与传统的放免的方法进行了比较,证明了其对判断新生儿甲状腺功能低下的有效性.检测灵敏度由12个零标准物所测量的平均值加3倍标准差决定,T4和TSH检测灵敏度分别为1013nmolΠL和017mIUΠL.通过对美国疾病控制中心(CDC)提供的新生儿的质控血斑进行测定,来确定方法的准确度和精密度.测定T4的低、中、高、质控品(真实值Π实测值):分别是2Π210μgΠdl,5Π419μgΠdl和7Π714μgΠdl.测定TSH的高、中、低质控品(真实值Π实测值)分别为:25Π23mIUΠL,40Π36mIUΠL和80Π69mIUΠL.由此可见方法的准确度很好.T4的变异系数为614%～10%,TSH的变异系数为412%～516%,方法的精密度也很好.根据放免试剂盒的T4正常参考下限值为167nmolΠL,TSH的正常参考上限值为20mIUΠL.在去除所有标本的标识条件下,用液相芯片技术测定了6例正常新生儿,T4的平均测定值为320nmolΠL(测定值范围为190～407nmolΠL)、标准误8118nmolΠL,TSH测定浓度小于10mIUΠL.在对6例诊断为甲状腺功能低下的新生儿测定中,T4的平均值为89nmolΠL(测定值范围为79～98nmolΠL),标准误为715nmolΠL,TSH平均值为332mIUΠL(测定值范围为72～499mIUΠL).作者认为3,液相芯片技术在新生儿甲状腺功能低下的检测中,提供了一个灵敏、精确和准确的方法,用极少量的血清可以同时对样本中的T4和TSH进行测定的.212在病毒抗体检测中的应用Wong等4用液相芯片技术检测了人血清和脑积液中,抗西尼罗河病毒(WN)外膜糖蛋白E(rWNV2E)的IgG