深海来源的微生物抗肿瘤活性筛选及次级代谢产物的初步研究

1深海来源的微生物抗肿瘤活性筛选及次级代谢产物的初步研究蔡生新，赵博宇，朱天骄，顾谦群*，（教育部海洋药物重点实验室，中国海洋大学医药学院，青岛，266003)摘要：目的对来自深海的海水、海泥样品进行了微生物分离并通过抗肿瘤活性筛选获得活性菌株，并研究活性菌株6a的次级代谢产物。方法从样品中选择性分离得到真菌，采用SRB法对分离得到真菌的发酵产物进行抗肿瘤活性筛选；采用现代分离手段对菌株6a发酵产物进行了活性追踪分离，通过理化性质及波谱学手段进行化学结构鉴定。结果与结论从深海来源的样品中共分离获得29株真菌，其中7株具有细胞毒活性；从活性菌株6a的发酵产物中分离得到10个单体化合物（1-10），其化学结构分别鉴定为8,9-dehydro-DesoxybrevianamideE(1)，8,9-dehydro-12,13-dehydro-DesoxybrevianamideE(2),8,9-dehydro-12-hydroxyl-DesoxybrevianamideE(3),8,9-dehydro-12-methoxyl-DesoxybrevianamideE(4),DesoxybrevianamideE(5),5-methoxysterigmatocystin(6),5,4’-demethoxylsterigmatocystin(7),5,4’-demethoxyl-sterigmatocystinA(8),4’-methoxylsterigmatocystin(9),averufin(10),其中化合物1-4、7-9为新化合物。关键词：深海来源真菌；次级代谢产物；抗肿瘤活性AntitumorscreeningofdeepoceanwaterandsedimentsderivedfungiandprimaryinvestigationoftheirsecondarymetabolitesCAISheng-xin,ZHAOBo-yu,ZHUTian-jiao,GUQian-qun*(KeyLaboratoryofMarineDrugs,ChineseMinistryofEducation,SchoolofMedicineandPharmacy,OceanUniversityofChina,Qingdao266003,China)ABSTRACT:OBJECTIVEThecytotoxicmicrobialstrainsisolatedfromthedeepoceanwaterandsedimentswerescreened,andthesecondarymetabolitesofactivefungus6awereinvestigated.METHODSActivemicrobialstrainswerescreenedusingchronicmedullaleucocythemia(K562)cellline.Bioactivefractionswereobtainedfromthecrudeextractof6athroughabioassay-guidedfractionationandthechemicalconstituentsofthefractionswereinvestigatedandpurifiedbythecombineduseofcolumnchromatographywithsilicagelandSephadexLH-20,thepreparativeHPLC.Theirstructureswereestablishedbyspectroscopicmethods.RESULTSANDCONCLUSIONTwentyninestrainsoffungiwereisolated.Amongthem,sevenstrainsshowedcytotoxicactivities.Tencompounds(1-10)wereisolatedfromtheactivestrain6aandidentifiedas8,9-dehydro-DesoxybrevianamideE(1)，8,9-dehydro-12,13-dehydro-DesoxybrevianamideE(2),8,9-dehydro-12-hydroxyl-DesoxybrevianamideE(3),8,9-dehydro-12-methoxyl-DesoxybrevianamideE(4),DesoxybrevianamideE(5),5-methoxysterigmatocystin(6),5,4’-demethoxylsterigmatocystin(7),5,4’-demethoxyl-sterigmatocystinA(8),24’-methoxylsterigmatocystin(9),averufin(10).Amongthem,compounds1-4and7-9arenewcompounds.Keywords:deepoceansedimentderivedfungi;secondarymetabolites;antitumoractivity深海生物处于独特的物理、化学和生态环境中，在高静水压、剧变的温度梯度、极微弱的光照条件和高浓度的有毒物质包围下，它们形成了极为特殊的生物结构、代谢机制系统。由于这种极端的环境，深海生物体内的各种活性物质具有较高的温度耐受性，较高的耐酸碱性、耐盐性及很强的抗毒能力。其体内的生物活性物质是研究开发海洋新药物的必然而有效的选择，也是目前深海微生物资源开发的热点。[1-3]本研究室近年选择海洋微生物这一可持续再生的重要资源，对采自太平洋深海海域的6个样品采用K562细胞为模型进行筛选，从中得到7株活性深海真菌。进一步对活性菌株进行了化学筛选和发酵条件的考察，最终对菌株6a进行大量发酵，采用活性追踪的方法，对其发酵物中活性次级代谢产物进行了提取分离，从中得到10个单体化合物，其化学结构分别鉴定为8,9-dehydro-DesoxybrevianamideE(1)，8,9-dehydro-12,13-dehydro-DesoxybrevianamideE(2),8,9-dehydro-12-hydroxyl-DesoxybrevianamideE(3),8,9-dehydro-12-methoxyl-DesoxybrevianamideE(4),DesoxybrevianamideE(5),[4]5-methoxysterigmatocystin(6),[5]5,4’-demethoxylsterigmatocystin(7),5,4’-demethoxyl-sterigmatocystinA(8),4’-methoxylsterigmatocystin(9),averufin(10),[6]其中化合物1-4、7-9为新化合物。1.实验部分1.1试验试剂和仪器高压灭菌锅：MLS3750（日本三洋株式会社）；洁净工作台：AirTech（苏州安泰空气技术有限公司）；高速离心机：（德国BECKMAN公司）；恒温培养箱：MIR-253（SANYO公司）；试管式振动培养箱：TC-C-100R（高崎科学器械株式会社）；旋转式振动培养箱：TC-C-100R（高崎科学器械株式会社）；超声仪：VC750（美国SONICS公司）；真空浓缩仪：SC250DDA（Savant公司）；相差倒置显微镜：CK40（OLYMPUS公司）；二氧化碳培养箱：MCO175（SANYO公司）；超净工作台：MCV-131BNF(T)（SANYO公司）；EYELAN-N型旋转薄膜蒸发仪：TokyoRikakikaiCO.LTD；核磁共振仪：日本JEOLJNM-ECP600型；制备高效液相色谱：日本岛津公司产品（LC-6AD泵，SPD-M20AVP检测器，SCL-10AV型系统控制器，YMC-packODS(A)，10×250mm，5μm，4mL/min）；Sephadex3LH-20：Pharmacia公司；硅胶H（200～400目）：青岛海洋化工厂产品。LiChroprep®RP-18（25-40m）：Merck公司产品。活性测试采用小鼠温敏型乳腺癌细胞tsFT210和人体慢性髓性白血病细胞K562；胎牛血清（FBS）和RPMI-1640细胞培养基分别为Hyclone公司（Cat.No.STF721）和GIBCOBRL公司产品；磺酰罗丹明B（SRB）为Sigma公司产品。常规提取分离用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿等均为工业用化学纯产品，重蒸后使用，液相色谱甲醇为色谱纯。1.2实验材料与方法样品来源：供分离的样品采自太平洋深海的海泥及海水。分离培养基：采用含海盐的PDA培养基。发酵培养基：甘露醇2%，麦芽糖2%，葡萄糖1%，味精1%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O0.03%，酵母浸膏0.3%，玉米浆0.1%，海盐3.33%，pH6.5。活性筛选材料：K562细胞购自中科院细胞库，tsFT210细胞由日本理化学研究所抗生物质研究室提供。1.3深海来源真菌分离方法样品采用稀释涂布法稀释一定梯度涂布于分离培养基上，15℃和28℃分别同时培养，[7]挑取形态差异较大的单菌落，纯化后接种于固体斜面培养基，长成后置于4℃冰箱中保存。1.4发酵培养及样品制备用500mL三角瓶装150mL发酵培养基，15℃和28℃，120rpm同时振荡培养，培养时间与初筛天数一致。发酵产物加150～200mL乙酸乙酯，振荡破碎5～10min，置于超声清洗仪中振荡至分层，乙酸乙酯层真空浓缩至干，加甲醇配成10mg·mL-1，待测细胞活性。1.5抗肿瘤活性筛选取对数生长期的K562细胞，用含10%FBS的新鲜RPMI-1640培养基配制成2×105个·mL-1的细胞悬液，接种到24孔板中，每孔0.5mL。各孔再加5μL样品溶液，留复孔空白对照。在37℃细胞培养箱中培养17h后，倒置显微镜下观察细胞形态，判断有无细胞坏死的形态学变化。1.6菌株的培养从15℃培养15d的PDA培养基上取适量菌体，接种于种子培养基中，于15℃、165rpm的条件下摇床培养2d得到种子培养液。将该种子培养液按10%的接种量，接种于50瓶每瓶含150mL液体培养基的500mL三角瓶中，21℃、120rpm摇床培养18d。发酵4批，发酵液共30L。1.7活性测试4取发酵液1mL，减压浓缩蒸干，然后溶于甲醇，得发酵液甲醇提取物，该粗提物在16mg/mL的浓度下，具有细胞毒抗肿瘤活性，称取该粗提物3mL，各取三份（每份200L）置于eppendorf管中，分别加入等体积的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取并利用SRB[8]（sulforhodamineB，丽丝胺罗丹明B）法测试活性，结果表明，只有乙酸乙酯萃取物具有抗肿瘤活性，故确定为有效活性部位。2.实验结果与讨论2.1深海来源样品真菌分离使用PDA和寡营养培养基作为分离培养基，6个样品中共分得真菌29株。2.2抗肿瘤活性筛选利用SRB法对分离得到的29株真菌进行细胞毒活性测试，共得到活性菌株7株，分别为真菌09ax，6a，c2b，8a，01c2a，01ac和01E3，其中菌株09ax，6a，c2b具有较强的细胞毒活性。2.3浸膏提取分离收集培养液30L，过滤发酵液和菌丝体，发酵液减压浓缩至5L，加入等体积的EtOAc，萃取3次，合并EtOAc提取液、减压浓缩至1L得发酵液浓缩液，菌丝体用等量的80%丙酮提取2次，减压浓缩至干后用等量的EtOAc提取3次，合并提取液并减压浓缩至1L得到菌丝体浓缩液，合并发酵液和菌丝体浓缩液并减压蒸干得到EtOAc提取总浸膏（35.0g）。取粗浸膏(35.0g)通过硅胶（300-400目）柱层析，利用石油醚/氯仿和氯仿/甲醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，得到5个组分。经活性测试，组分Fr.3具有活性。经反复的正反相硅胶柱色谱、SephadexLH-20柱色谱和半制备高效液相色谱等分离手段，从Fr.3分