自动生化分析仪基本参数及应用

自动生化分析仪基本参数及应用试剂研发部张莉2007年7月•了解生化分析仪基本参数的原理•为正确使用仪器、试剂提供指导•有助于正确分析和处理测定数据目的主要内容•分析方法简介•分析参数设置分析方法简介•终点法（平衡法）：TP、Glu等•动力学法（连续监测法）：ALT、CK等•固定时间法（两点速率法）：CREA(苦味酸法)、UREA•免疫透射比浊法：IgA、CRP等•胶乳增强免疫比浊法：HS-CRP必选分析参数•项目名称•方法类型•波长（主/次）•样本量•试剂1量/试剂2量•孵育时间（双试剂）•延迟时间•反应时间等备选分析参数•样本预稀释•样本空白•参考值范围•可报告范围等•试剂空白吸光度范围•试剂空白速率•底物耗尽限•抗原过剩限某些重要的分析参数介绍及设置•波长•试剂空白•底物耗尽限•延迟时间•反应时间•抗原过剩限波长的选择•单波长当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用单波长。如果一个物质有几个吸收峰，可选用吸光度最大的一个波长，或者选择在吸收峰处吸光度随波长变化较少的某个波长。•双波长当反应液中存在干扰物的较大吸收、从而影响测定结果的准确性时，采用双波长方式更好。消除噪音干扰减少杂散光影响减少样品本身光吸收的干扰波长的选择•单波长测定易受样品溶血、黄疸、脂浊等因素干扰。双波长测定可以通过副波长加以修正，减少甚至消除干扰因素，提高测定准确性。溶血、脂血、黄疸等的光谱吸收特性图中，λ11=340nm,λ13=415nm,λ14=450nm,λ15=480nm,λ16=505nm,λ17=546nm,λ18=570nm,λ20=660nm,λ21=700nm,λ22=850nm,波长的选择测定波长选择有三个主要条件：•待测物质在该波长下的光吸收最大。•其吸收峰宜较宽而钝，而不是处于尖峰或陡肩，一般不选光谱中的末端吸收峰，换句话说，该吸收峰处的吸光度随波长变化较小。•常见干扰物在该波长下的光吸收最小。试剂盒说明一般已提供波长参数。实际波长选择需要了解待测物质和干扰组分对不同波长单色光的吸收程度，即以波长为横坐标、吸光度为纵坐标作吸收光谱曲线(光吸收曲线)。波长的选择•先主后次。•被测物：主次差异大。•干扰物：主次差异小。•双波长选择常见：血红蛋白340nm和380nm波长吸光度相同，以NADH作为测定底物或产物的试验常采用340／380nm；有的也采用340／405nm。ALP和GGT常使用405/476nm，Trinder反应多选取520／600nm或550/660nm．免疫比浊常选用340／700nm等。试剂空白•试剂空白参数试剂空白吸光度范围试剂空白速率用于监测试剂质量及仪器稳定性，利用试剂空白对试剂本身或反应漂移引起的误差进行补偿，用以校正△A或△A/min。试剂空白吸光度Trinder反应：≤0.1-0.4•反应吸光度向上的取上限值：以结合型硝基苯衍生物为底物：≤0.6~0.8•反应吸光度向下的取下限值：≥1.0•每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的变质。但试剂吸光度上限和下限不是试剂质量的唯一指针。一定的校准频率和室内质控是质量保证的必需手段。迈瑞部分生化试剂的空白吸光度要求项目名称反应原理试剂空白吸光度要求ALTNADH→NAD+1.0AASTNADH→NAD+1.0AHBDHNADH→NAD+1.0AALP磷酸对硝基酚→对硝基酚0.8AGlu（氧化酶法）Trinder反应0.4AUATrinder反应0.3A试剂空白监测参数•试剂空白速率顾名思义就是在反应过程中对试剂空白的变化速率作连续监测（以水为样本），其数值在样品测定结果中自动扣除。此参数主要用于连续监测法。还原型辅酶，本身不稳定而分解，多呈下降趋势底物自发降解硝基苯衍生物，在碱性条件下自发水解，多呈上升趋势杂酶或干扰物的影响：胆红素对苦味酸法测肌酐的影响一般认为酶活性测定的试剂空白速率(△A/min)应≤0.001~0.003底物耗尽限•仅对动力学法有效，对于采用负反应分析酶活性的方法甚为重要。•一些高浓度（活性）样本使底物耗尽，使反应不再为0级或1级反应，为能正确反映测定结果，需设置底物耗尽限（某一特定吸光度），该吸光度应正好是反应曲线中线性区与非线性区或1级反应区与多级反应区的临界点。•在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超过其底物耗尽限，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示，该样品应稀释一定的倍数重新测定。•某一项目的底物耗尽限与所用试剂盒密切相关。AST试剂出现底物耗尽的反应曲线延迟时间•一般用于两点法和速率法，某些情况下也用于终点法。•在酶促反应一开始的阶段，由于各种因素的影响（血清成分复杂、初期杂反应多等），酶促反应速率比较慢，必需经过一段时间才能进入稳定反应期。可以是几秒到几分钟，尤其是双底物反应或需要辅酶参与者，通常为1-3min。延迟时间•设置一般根据试剂盒的说明书，还应考虑仪器特点和试剂方法学等。•仪器特点半自动：流动比色池全自动：读数设置方式•试剂及方法学试剂组成：工具酶数量、偶联反应方法学要求：干扰反应反应时间•终点法•动力学法/固定时间法反应时间•在葡萄糖氧化酶法中，葡萄糖氧化酶高特异性催化β-D-葡萄糖，而血清中葡萄糖α和β构型各占36%和64%，要使葡萄糖完全反应，必须延长孵育时间使α-葡萄糖变旋为β构型。•总胆固醇、甘油三酯都采用酶法的Trinder反应进行测定，但该反应37℃反应较慢，必须测定这些酶试剂反应达到终点的时间。反应时间•连续监测法至少90-120s或至少4点（3个ΔA）。少于3个ΔA不能称为连续监测法，因为不能计算线性度；监测时间过长则容易发生底物耗尽，可测范围变窄。•线性度是指“线性错误”或“线性误差”，其计算公式为：（A1-A2）/A3×100%式中：A1为前2/3读数时间的斜率，A2为后2/3读数时间的斜率，A3为总的斜率。线性百分数大，说明ΔA之间已不成线性，超过限额说明底物不足，检测结果会变低，应稀释后重测。抗原过剩限•免疫比浊分析过程中设置。比较免疫比浊分析过程中前后两个读数点的差别，如果后一点比前一点的吸光度低，则表示抗原已过剩，应将样品稀释后重测。•某一项目的抗原过剩限与所用试剂盒密切相关。抗原剂量反应曲线图（IgG）某些参数的特殊意义•最小样品量最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量。一般分析仪的最小样品量是2μl，目前有小至1.0μl的。在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采用分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围（与线性范围不同）的上限得以扩大。•样本量和试剂量设置原则一般是根据试剂说明书上的比例，并结合仪器的特性进行设置。仪器的特性包括：样品和试剂的最小加样量及加量范围、最小反应液的体积等。在实际工作中为节约成本可以根据比例缩小样品和试剂用量，但同时必须满足最小反应液总量。几种生化仪的样本量及试剂量比较仪器型号样本量（ul）试剂1量（ul）试剂2量（ul）反应液总体积（ul）BS-2003～45180～45030～450183～500BS-3003～45180～45030～450183～500BS-4002～45150～35020～350152～360日立70202～5020～350180～500日立70603～5050～350250～500日立71702～3520～270180～380某些参数的特殊意义•样本/试剂量比方法学方面：仪器设备和试剂厂家有差异，因此对于试剂厂家给定的样本试剂比并不一定能保证临床分析的可靠；对试剂进行可报告范围评估时，某些项目的高值样本难于获取；受生化分析加样系统的限制（主要是一些离心式生化分析仪）；受生化分析仪光电探测器的制约。某些参数的特殊意义•改动样本试剂比受很多因素限制受测定方法的制约受光电探测器线性的制约受光电探测器分辨率的制约受朗伯比尔定律的制约样本空白•由于溶血、脂血、黄疸等情况，会导致样本本身的吸光度对测试结果造成影响。所以对样本本身吸光度的测量，即样本空白，可以去除这方面的影响。可报告范围•按试剂的质量而设置，超过范围应增加样品量或稀释后重测。不同试剂公司的试剂质量不一样，不同样品试剂比的可报告范围也不一样，应实测试剂盒的可报告范围。其他•不同的生化分析仪，其参数组成和设置有一定的差异。如：反应温度、总反应容量、弹性速率等。•结果单位、小数位数、项目编号等。参数调整举例•有些时候由于参数设置的原因，造成一些项目的结果不对或异常，可以通过反应曲线来初步判断。反应时间的影响•例1：某酶类试剂反应时间的影响•例2：Glu关于参数修改•配套系统的原装分析参数不宜更改；采用非仪器配套的试剂及校准品体系时，参数修改要慎重。THANKS！