分子标记辅助选择育种一、概念:DNA分子标记:指以DNA遗传多态性为基础的一类遗传标记。二、分子标记的优点•能稳定遗传;•多态性高、揭示的信息量大;•无表型效应;•不受环境影响;•不受组织和发育阶段的影响;•表现中性•……三、分子标记种类(一)基于Southern杂交的分子标记RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism,限制性内切酶酶切片段长度多态性)标记;(二)基于PCR的分子标记1.随机引物PCR标记:RAPD(randomlyamplifiedpolymorphicDNA,PCR随机扩增基因组DNA多态性)标记;ISSR(inter-simplesequencerepeats,简单重复序列间区多态性)标记。(2)特异引物PCR标记:SSR(simplesequencerepeats,简单序列重复,微卫星)标记;STS(sequencetagged-site,序列标签位点)标记;DD-PCR(differentialdisplayPCR,差异显示PCR)标记。PCRprocedure5’amplicon3’3’5’94℃56℃72℃Cycle12分子Cycle24分子Cycle38分子(三)基于PCR和限制性酶切的分子标记AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,PCR扩增限制性内切酶酶切片段长度多态性)标记;(四)基于单核苷酸多态性的分子标记SNP(singlenucleotidepolymorphism,单核苷酸多态性)标记主要类型DNA分子标记的比较RFLPRAPDISSRAFLPSSRSNP遗传特点共显性多数显性共显性多数显性共显性共显性多态性中等较高较高高高极高检测基因座位数1~31~101~1020~200多数为1多于100DNA质量要求高低低高中等高DNA用量2~1010~2525~502~525~501~50技术难度高低低中等低极高放射性通常是不是不是通常是不是不是可靠性高低高高高高耗时多少少中少很少成本高较低较低较高中等很高4.1RFLP标记1980年,Botstein和White等构建了人类遗传连锁图,500多个RFLP位点,定位了Huntington病,CF(囊性纤维化)和癌相关基因(APC,DCC等)。四、分子标记的原理和遗传特点•技术:随机合成10-mer引物的PCR•依赖:引物靶位点的突变(显性效应)引物靶位点间序列大片段的缺失,插入(共显性效应)•特点:随机序列引物随机检测等位基因周期短,操作简单,灵敏度高,DNA用量少重复性差,扩增的片段一般小于2kb,不需要模板基因组DNA的任何信息.随机引物数目的增加所检测到的RAPD理论上可覆盖整个基因组4.2RAPD标记1990年,Williams和Welsh等RAPD(RandomlyAmplifiedPolymorphismDNA)引物1234510mer序列随机商业购买种类无限4.3SSR标记SSR是一类由2-4个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸片段的串联重复序列,其两侧由特异序列构成。首先发现于人类基因组中,现已发现存在于许多真核生物中,如哺乳动物、鱼类、鸟类、昆虫类、单子叶植物、双子叶植物中SSR也广泛存在。SSR标记基本原理:以重复序列及两侧的特异序列作模板,以与特异序列互补的特异引物来扩增SSR等位基因,扩增产物在高浓度的琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶上电泳检测。多态性来源:通常是SSR结构内部重复单元的数量变化或重复单元的序列变异引起的。SimpleSequenceRepeats-SSRP1P2扩增电泳5repeats7repeatsP2P1A9repeatsB5repeatsC13repeatsPCRABCSSR多态性分析示意图ABC分别代表不同的基因型40共显性标记优点:高多态性;SSR位点在染色体上分布均匀;引物具有一定的通用性;共显性标记;缺点:可用的位点数目少;设计引物的费用高,耗时长;物种专一性;引物的开发有一定难度。SSR标记SSR引物在大豆中的扩增谱带SimpleSequenceRepeats-SSR水稻RM163位点上的25个等位基因玉米回交群体的SSR图谱水稻25份种质的SSR分析394.5ISSR标记(Inter-simplesequencerepeats)Zietkiewicz提出,检测的是两个SSR之间的一段短DNA序列上的多态性。原理:利用真核生物基因组中广泛存在的SSR序列,设计出各种能与SSR序列结合的PCR引物,对两个相距较近、方向相反的SSR序列之间的DNA区段进行扩增。5`-3`序列Sequence扩增条带数Amplifiedfragments多态性标记数Polymorphicfragments5`-3`序列Sequence扩增条带数Amplifiedfragments多态性标记数PolymorphicfragmentsGGG(ACA)577TTC(CCA)586GAT(ACA)5124GAG(CGA)598GAC(ACA)595GTT(CGA)587GGG(CCA)564GCC(CGA)587GAT(CCA)588AAG(CGA)5139GAC(CCA)5105ATT(CGA)584AGG(CCA)585ATC(CGA)5113AAT(CCA)587TAG(CGA)5109AAC(CCA)51210TTT(CGA)596TGG(CCA)597TCC(CGA)597TAT(CCA)5664.6SSCP(单链构象的多态性)(SingleStrandConformationPolymorphism)ATGC变性复性SSCP(单链构象的多型性)(SingleStrandConformationPolymorphism)家猪氟烷基因SSCP图谱MNAAAAAAAAAAAmRNAMNAAAAAAAAAAANMTTTTTTTTTTTTT扩增电泳回收,克隆测序,探针MNAAAAAAAAAAANMTTTTTTTTTTTTTcDNA4.7DD-PCR(Differentialdisplay-PCR)3’端锚定引物:11个或12个连续的T加上两个3’-端锚定的脱氧核苷酸组成10-mer的随机引物DD-PCR(基于PCR的差异显示)技术:cDNA合成randomprimerPCRanchorprimerPCR依赖:等位基因在转录水平上的差异表达;等位基因的结构变异;DD-PCR•技术:RarecutterRE(6Ntsite,EcoRI)FrequencycutterRE(4Ntsite,TaqI,MseI)adaptersequenceprimer(adapter+Cuttingsite)PCR&PAGE•依赖:RE切点的突变切点3’序列的突变4.8AFLP标记1993年Zabeau和Vos发明是RFLP和PCR相结合的一种技术。AFLP技术流程酶切连接预扩增选择性扩增电泳AgNO3染色基因组DNA的提取结果分析AFLPprocedureAFLP引物1.核心碱基序列(core):与接头互补2.限制性内切酶识别序列(ENZ)3.引物3’末端的选择碱基(EXT)EcoRIadaptor:5’--CTCGTAGACTGCGTACC--3’3’--CTGACGCATGGTTAA5’E00:5’--GACTGCGTACCAATTC3’MseIadaptor:3’—AATGAGTCCTGAGTAG—5’M005’—TACTCAGGACTCAT--3’3’—GAGTCCTGAGTAGCAG--5’52优点:只需要极少量的DNA模板;不需要Southern杂交;不需要预先知道DNA的序列信息;重复性好,可快速获得大量信息。缺点:受专利保护AFLP标记51AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)五、分子标记在生物技术中的应用1.建立高密度的遗传连锁图谱2.遗传多样性和物种亲缘关系编号序号材料号编号序号材料号编号序号材料号编号序号材料号1R-1扬农啤6号25R-25BARI-17649S-1朸系14373S-25BARI-1472R-2扬农啤7号26R-26BARI-18050S-2连87-34-274S-26BARI-1613R-3苏农91-711227R-27BARI-19251S-3福84-810475S-27BARI-1624R-4广麦940228R-28BARI-19852S-42004-日引3号76S-28BARI-1665R-5扬农2号29R-29BARI-19953S-5甘啤2号77S-29BARI-1716R-6盐93-14630R-30BARI-21254S-6连901578S-30BARI-1737R-7浙934331R-31BARI-23055S-7驻9505-1-379S-31BARI-1748R-8浙708232R-32BARI-23456S-8苏引麦3号80S-32BARI-1759R-9浙95-5433R-33BARI-24057S-9单281S-33BARI-17810R-1093-16634R-34BARI-24558S-10苏引麦2号82S-34BARI-18911R-11矮杆-135R-35BARI-26859S-11驻92017-0-2-183S-35BARI-20412R-12苏农647236R-36BARI-27860S-12驻96015-5-284S-36BARI-21313R-13浙农大7号37R-37BARI-28061S-132004-日引1号85S-37BARI-23614R-142004-日引4号38R-38BARI-28262S-14新洋01-386S-38Z052K001915R-15扬饲麦3号39R-39Z012L031L63S-15盐95-22187S-39BARI-25816R-16扬农啤4号40R-40Z010JV45J64S-16盐96-16688S-40BARI-29117R-17苏啤3号41R-41Z127O108O65S-17矮杆-489S-41Z001L132L18R-18扬辐208542R-42Z127O115O66S-18KA-4B90S-42Z010J016J19R-19扬农啤8号43R-43Z149O046O67S-19华232891S-43Z125O009020R-20扬农啤5号44R-44BARI-21068S-20楚大麦3892S-44Z1270087021R-21720445R-45ZB00-014069S-21鄂大麦9号93S-45Z1380024P22R-22扬啤1号46R-46Z1170016P70S-223238094S-46Z029P03323R-23泰兴94-2547R-47Z1390023P71S-23500395S-47Z058P008P24R-242004-日引2号48R-48Z028P057P72S-24连啤1号96S-48Z067P035P引物染色体位点数PIC引物染色体位点数PIC引物染色体位点数PICGMS0211H30.46Bmag00063H30.39Bmag02225H20.26Bmag05041H40.54GBM12423H20.32scssr071065H20.37GBM10321H40.29Bmac08773H50.59Ebmatc00035H20.14Bmag02111H30.43GBM12533H20.29Bmag03945H20.35GBM10041H30.5Bmac02093H30.48scssr039075H40.6GBM14511H20.3HVM703H30.28Ebmac06026H30.4Bmac00321H20.3Bmag08084H20.36Bmag04966H30.46GBM11431H20.37GBM10034H30.26Bmag02106H30.4Bmag01342H30.34Hvm684H40.46Bmag00096
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