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蟾蜍冬眠时温度对体重和血糖含量以及肺的影响实验目的：蟾蜍具有很高的经济价值，其中蟾酥是一种名贵的中药材。本实验通过改变温度，对冬眠时期的蟾蜍体重和血糖的测量，观察蟾蜍肺组织切片，从而研究处于冬眠时期的蟾蜍，温度对它体重，血糖以及肺组织的影响,进而使得蟾蜍养殖户能更好的利用本实验结果进行有效管理，合理安排资源，使蟾蜍安全越冬。实验原理：蟾蜍冬眠期间是不进食的，通过消耗体内的脂肪来提供必要的生命活动能量。蟾蜍在进入冬眠后它的脂肪消耗会大大减少。进行测量观察找出蟾蜍在冬眠期间内某一温度范围的体重减少量是最少的。冬眠期间蟾蜍不进食，血糖含量应该是降低的，在不同温度条件下蟾蜍要维持必须的生命代谢所消耗能量是不同的，所以会存在血糖含量差异的扩大。冬眠期间蟾蜍是用皮肤进行呼吸，而非冬眠的蟾蜍是用皮肤辅助肺呼吸。实验仪器：电冰箱，血糖仪，电子天平，剪刀，注射器，切片刀，切片机，恒温箱，温台，熔蜡炉，蜡杯，酒精灯，蜡铲，展片台，解剖刀，解剖针，解剖剪，解剖盘，培养皿，吸管，镊子，单面刀片，台木，毛笔，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅，聚氨脂泡沫饭盒,PE手套。实验试剂:：卡诺氏固定液（无水酒精3份:冰醋酸1份或无水乙醇6份，氯仿3份，冰醋酸1份）、FAA固定液（50%或70%酒精90ml+冰醋酸5ml+福尔马林(37%~40%甲醛)5ml）、各种浓度的酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）、二甲苯、石蜡、蜂蜡、埃利希苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，甘油蛋白粘片剂，郝普特氏粘片剂，中性树胶。1%番红，1%固绿，1%过碘酸，Schiff试剂，0.5%偏重亚硫酸钠溶液，醋酸酐-吡啶混合液，0.5%~1%淀粉糖化酶溶液。石蜡切片制作过程（苏木精-伊红对染法）1、固定液、染色液的配置（1）Bouin氏液苦味酸饱和水溶液75ml37%~40%福尔马林液25ml冰醋酸5ml苦味酸饱和溶液的浓度为100ml水中加1g苦味酸。（2）Mayer苏木精液苏木精1g蒸馏水1000ml铵矾或钾矾50g碘酸钠0.2g柠檬酸1g水合氯醛50g将苏木精溶于蒸馏水内（需要时可微热），加入研细的明矾，摇震助溶（需要时再加温），明矾溶解后，依次加入碘酸钠、柠檬酸、水合氯醛等试剂。配制后即可供使用。（3）曙红曙红0.5~1g蒸馏水100ml混匀后过滤2、取材:蟾蜍肺脏组织器官（1）切取的组织块不宜太大，以便固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10mm×10mm×2mm为宜。取下所需要的肺组织，切成一小块2~3mm厚。（2）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。（3）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能3、固定：将切好的肝组织用生理盐水冲洗后，立即投入卡诺固定液中固定，固定30~50min。（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，可能失去固定作用。（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1~2次新液。（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。4、洗涤材料经固定后，除乙醇外，组织中的固定液必须冲洗干净，尤其是含有重金属的固定液。因为残留在组织中的固定液，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察。冲洗方法根据固定液的性质而定，固定液为水溶液的常用水洗涤，固定液含有乙醇的则用50%~70%乙醇冲洗。5、脱水用30%、50%、70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水各40min，放入95%、100%各两面三刀次，每次20min。各种材料经固定与洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸管吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。（3）在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。（5）如需过夜，应停留在70%酒精中。（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象6、透明95%酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h（或至透明为止），须换一次二甲苯。由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。（1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。（2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。（3）在透明过程中，如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。7、浸蜡/透蜡放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各20~30分钟。透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织的透蜡时间较长，约需1~2d。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55~60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。置于恒温箱0.5h。（1）尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；（2）透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；（3）操作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。7、包埋将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块。用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间，包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为52~56℃，植物材料用的石蜡熔点为54~58℃。包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯3，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在面盆，并立即使它沉入水中，使盒中包埋块迅速凝固。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。8、、切片与粘片（1）切片①将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4~10微米。⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40~50r/min。⑦切成的蜡带到20~30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。⑧用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。（2）粘片/贴片①、取一片清洁的载玻片，滴一滴粘片剂于玻片中央，然后用洗净的手指加以涂抹，便成均匀薄层。②、滴1~2滴的蒸馏水已涂粘片剂的载玻片上。③、用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上，注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。④、把玻片摆好片位置，在酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展。或放置置于预先加热的展片台上（温度保持在40~45℃）。此时蜡片因受热而伸展摊平。并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。⑤、展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于37℃温箱烘干，一昼夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。9、脱蜡复水石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各3~5min，再放入蒸馏水中3min。染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多。10、染色切片放入苏木精中染色约10~30min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。11、水洗用自来水流水冲洗约15min。冲洗过程中使切片颜色发蓝（或放入碱性水中也可，但用促蓝剂对伊红可能拒染，如果时间来得及，应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜），但要注意流水不能过大，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。12、分化将细胞质着的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟。这一步骤是H.E.染色成败的关键，，如分化不当会导致染色不匀，或深或浅，得到的切片染色效果差。如果染色适中，可取消此步骤。13、漂洗切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次。14、脱水Ⅰ切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5min。15、复染用0.5%伊红乙醇液对比染色2~5min。伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。16、脱水Ⅱ放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3~5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。17、透明切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中约5min，然后放入纯二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。18、封藏：中性树胶封存切片经染色、脱水、透明后，即可用封藏剂将其封藏起来，目的是永久保存切片，便于镜检。常用的封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶、加拿大树胶等，另一类为湿性封藏剂如甘油明胶等。如果切片是经二甲苯透明，则用树胶作为封藏剂，树胶可以用二甲苯稀释至合适的稠度。如果切片是直接从水中或水溶液中取出，则常用甘油明胶作为封藏剂，可用于短期保存标本。封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。材料透明后，按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，脱水过程,在脱水时进行抽气减压。沿肺门切开放入乙醇-乙酸-甲醛混合液(AAF液:95%酒精80ml+乙酸5ml+福尔马林15ml)固定5min,然后切成1.0×0.8×0.2cm组织块,继续固定30min后分成4组(每组10个标本块),各放入100ml广口盐水瓶,加脱水剂95%乙醇至容量瓶的1/3后盖上橡皮塞。A组:传统方法,不抽瓶内空气;B组:用50ml注射器(6号针头)抽去瓶内空气50ml;C组:抽去瓶内空气150ml;D组:抽去瓶内空气250ml。抽气后拔除针头同时立即用石蜡把瓶口封好,使瓶内维持一定负压4～6h后,第二道95%乙醇、第三道100%乙醇继续脱水。后常规透明、浸蜡、包埋制成蜡块,切片、烤片、染色封