温度对蟾蜍冬眠的影响

温度对蟾蜍冬眠的影响实验目的：通过改变温度，通过对蟾蜍体重和血糖的测量，做到进一步对蟾蜍的生活习性的了解。实验原理：蟾蜍冬眠期间是不进食的，通过消耗体内的脂肪来提供必要的生命活动能量。蟾蜍在进入冬眠后它的脂肪消耗会大大减少。葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并产生过氧化氢：在色原性氧受体(如联大茴香胺，4—氨基安替比林偶联酚)的存在下，过氧化物酶催化过氧化氢，氧化色素原，生成有色化合物。实验仪器：电冰箱，电子天平，离心机，PE手套，移液枪，容量瓶，烧杯，棕色广口瓶，滴管，烤箱。实验试剂：1．0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7．0)：溶解无水磷酸氢二钠8.67g及无水磷酸二氢钾5．3g于800ml蒸馏水中，用lmol/L氢氧化钠或盐酸调节pH值至7．o，然后用蒸馏水稀释至1L；2．酶试剂：取葡萄糖氧化酶1200U，过氧化物酶1200U，4-氨基安替比林l0mg，叠氟钠100mg，加上述磷酸盐缓冲液至80ml左右，调节pH值至7．0，加磷酸盐缓冲液至100ml，置冰箱保存，至少可稳定3个月；3．酚溶液；重蒸馏酚100mg溶于l00ml蒸馏水中，贮存于棕色瓶中；4．酶酚混合试剂：酶试剂及酚溶液等量混合，在冰箱内可以存放1个月；5．葡萄糖标准贮存液(100mmol／L)：称取无水葡萄糖(预先置80'C烤箱内于燥恒重，移置于干燥器内保存)1．802g，以12mmol儿苯甲酸溶液溶解并移入100ml容量瓶内，再以12mmol／L苯甲酸溶液稀释至l00ml刻度处，放置至少2h后方可应用；6．葡萄糖标准应用液(5mmol/L)：吸取葡萄糖标准贮存液5ml，于l00ml容量瓶中，用l2mmol儿苯甲酸溶液稀释至刻度，混匀。7．蟾蜍血液8．20只蟾蜍做实验动物。试验方法：将20只蟾蜍分为A、B两组，每组10只蟾蜍。A组用网格纸盒A,B组用网格纸盒B进行试验。将A组分别标记为A1，A2，A3，A4，A5，A6，A7，A8，A9，A10。将B组分别标记为B1，B2，B3，B4，B5，B6，B7，B8，B9，B10。然后将A组与B组每一只蟾蜍分别称重记录数据填入表一。将B组蟾蜍分别进行采血，做血糖含量的测定。将记录的数据填进表二。采血的方法：（1）蟾蜍的抓取与固定①抓取方法：直接用左手将蟾蜍背部紧贴手掌，以中指，无名指，小指压住其左腹侧和后肢，拇指和食指分别压在左，右前肢，以右手进行操作。在抓取蟾蜍时，不要挤压其两侧耳部突出的毒腺，以免毒液溅入操作者眼中②固定方法：可破坏其脑脊髓或麻醉后用大头针固定在蛙木板上，可依实验需要采取俯卧位或仰卧位。（2）然后将蟾蜍用注射器从蟾蜍的腹壁静脉处抽取0.1ml的血液后，置离心机，4℃，3000r/min离心，10min。取上清液0.02ml盛放在测定管中(16mm×100mm)，加入血清0.02ml,于测定管当中，葡萄糖标准应用液加入标准管里0.02ml，设置对照管，加蒸馏水0.02ml。再给每管加3.0ml的酶酚混合试剂。（3）混匀，置37'C水浴中，保温15min，用分光光度计，波长505nm，比色杯光径1.0cm，以空白管调零，分别读取标准管及测定管吸光度。（4）利用公式计算注意事项：1．葡萄糖氧化酶对β-D葡萄糖高度特异，溶液中的葡萄糖约36%为α型，64％为β型。葡萄糖的完全氧化需要α型到β型的变旋反应．国外某些商品葡萄糖氧化酶试剂盒含有葡萄糖变旋酶，可加速这一反应，但在终点法中，延长孵育时间可达到完成自发变旋过程。新配制的葡萄糖标准液主要是α型，故须放置2h以上(最好过夜)，待变旋平衡后方可应用。2．过氧比物酶的特异性要比葡萄糖氧化酶的特异性低得多，一些还原性物质如尿酸、抗坏血酸、胆红质和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反应过程中所产生的过氧化氢，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。然而，在本法的测定条件下，溶血标本血红蛋白浓度达l0g／L，黄疽标本胆红质浓度达342μmol／L，均不影响测定结果．氟化钠浓度达3g／L不干扰测定结果。标本中含尿素浓度达46.7mmol／L(280mg／dl)，尿酸浓度达2.95mmol／L(50mg／dl)，肌酐浓度达4.42mmol／L(50mg／dl)，半胱氨酸浓度达50mg／dl，甘油三酯浓度达500mg／dl，对测定结果均无显著影响。3．葡萄糖氧化酶法可直接测定脑脊液葡萄糖含量，但不能直接测定尿液葡萄糖含量。因为尿液中尿酸等干扰物质浓度过高，干扰过氧化物酶反应，造成结果假性偏低。4.方法学评价：GOD法线性范围至少可达19mmol／L;回收率94％～105%；变异系数批内为0．7％～2.0％；批间为2%左右；日间为2％～3％。准确度与精密度都能达到临床要求，操作简便，适用于常规检验。5．测定标本以草酸钾—氟化钠为抗凝剂的血浆较好。取草酸钾6g，氟化钠4g，加水溶解至l00ml。吸取0．1ml到试管内，在80℃以下烤干使用，可使2～3ml血液在3—4天内不凝固并抑制糖分解。表一：温度时间蟾蜍体重的变化A1A2A3A4A5A6A7A8A9A10备注10℃8℃6℃4℃2℃0℃-2℃-4℃表二：温度时间蟾蜍血糖的变化A1A2A3A4A5A6A7A8A9A10备注10℃5℃0℃-4℃(5)结果进行分析标本体重（Kg）温度℃标本血糖温度