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果皮中酵母菌的分离与纯化一、实验目的应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。二、实验原理酵母菌常见于含糖比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。三、器材和用品1、苹果皮、葡萄皮等。2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为5.5左右。4、无菌吸管、无菌培养皿、涂布棒、美兰染液、显微镜、接种环等。四、实验方法1、接种：取果皮（不需冲洗）5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h-48h，可见培养液变浑浊。2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1ml，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h-48h。3、分离纯化:用1ml的无菌吸管单独吸取上述培养液至9ml的无菌水中便是10-1如此稀释10-2、10-3。马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用1ml的无菌吸管吸取10-3培养液至培养基表面，用无菌的玻璃刮产迅速涂抹均匀，而后做好标记放置恒温箱培养大约24-48小时（培养皿倒置），菌落长出后，观察菌落，并镜检菌体，一般一个单独的菌落可视为一个细胞发育而来，是纯培养，如果结果复杂，未得纯培养，可进行再次分离培养（划线法），直到纯化为止（注意保藏菌种），对纯化菌种再次固体培养24h-48h，观察菌落特征（特征:菌落质地是否为奶酪状、粘液状。菌落颜色常为乳白色、奶油色、红色等。菌落表面是否反光或暗淡，是否平滑或粗糙，有无纹状皱折或疣状突起，菌落边缘是否光滑。）以及是否有酒香味。并拍照。3、分离纯化：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取0.1ml加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h-48h。然后用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。4、镜检：挑取单菌落，制片观察其形态（美兰染色水浸片）。观察记录(拍照)细胞的形态、大小和出芽方式。5、菌种保藏：接种酵母菌到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，长出菌苔后冰箱保藏。