果蝇唾腺染色体的标本制备和观察

果蝇唾腺染色体的标本制备和观察摘要多线染色体存在于某些生物特定生命周期的某些细胞中。本实验观察的多线染色体是果蝇唾腺染色体，在其染色体标本中可以观察到果蝇唾腺染色体形态巨大，由5条长染色体和1条短小的染色体组成，他们聚集在染色中心，横纹条带深浅不一，疏密各异，遍布每条多线染色体臂，有些地方有还胀泡出现。由于多线染色体因其形态巨大，横纹明显，它常被作为基因定位的良好材料，并且广泛应用于细胞遗传学、发生遗传学、进化遗传学及分子遗传学的研究中。关键词多线染色体果蝇唾腺染色体横纹胀泡1.引言染色体由DNA和蛋白质构成，作为DNA的载体，有着不可或缺的的作用，因此是科学家广泛研究的材料。然而染色体的研究通常面临两个困难：一是染色体很小；二是除极少数动植物，如玉米粗线期的染色体上具有染色粒这样的结构可以作为识别或定位的标志外，大多数生物的染色体都没有标志。而多线染色体的染色体足够大，染色体上的识别标记足够多，这将对遗传学研究将提供不少的便利。本次实验观察的多线染色体有如下特征：①果蝇唾腺染色体是一种缆状的巨大染色体。由于果蝇幼虫的唾腺细胞发育至一定阶段就停止有丝分裂，终止在间期，但唾液腺细胞核的染色体仍不断地进行自我复制，但并未发生细胞核分裂，复制后的子染色体彼此不分开，形成了多线染色体，对于黑腹果蝇唾腺染色质的复制可达9次之多，单条染色体臂可达275μm，约为普通中期染色体的150倍。②果蝇唾腺染色体由5条长染色体和1条短小的染色体组成，他们聚集在染色中心。唾腺染色体由于体联会的原因只有二倍体的单元数，第Ⅰ染色体（X染色体）为端着丝粒，所以染色体的一端在染色中心上，另一端游离，第Ⅱ、Ⅲ染色体均为中着丝粒，它们从染色体中心呈V字形向外伸展，所以分别能看到2L(leftarm)、2R(rightarm)、3L和3R4条长臂；点状的第Ⅳ染色体很短小，为端着丝粒。因此，可以见到5条很长的和一条紧靠染色体中心的短小的染色体。在雄性幼虫中，唾腺染色体上不见Y染色体，它不与X染色体联会，而且其着丝粒及其附近的异染色质参与染色中心的形成。这可能是雄性幼虫唾腺染色体中的X染色体比其他几对常染色体相对狭窄一些的缘故。染色中心是唾腺染色体形成时，各条染色体的着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚积在一起形成一种结构，此处的染色质连接不紧密，横纹结构也不明显。③果蝇唾腺染色体横纹条带深浅不一，疏密各异，遍布每条多线染色体臂。染色质丝的不同部位螺旋化程度不同。其中螺旋化程度较高的形成染色较深的暗纹，螺旋化程度较低的部位形成了染色较浅的明纹。横纹数量巨大，在黑腹果蝇中可达5000多条。果蝇唾腺染色体每一臂上所有的横纹的数目、大小和位置是恒定的，即具有种的特征，横纹又与某些特定的基因相联系，因此其可以作为基因定位的依据，横纹数目和排列的变化可以作为染色体结构改变（缺失、倒位、易位等）的依据。④果蝇唾腺染色体臂上可观察到胀泡。当基因活跃转录的时候，多线染色体上的DNA会解开螺旋，染色体某些带纹变得疏松膨大而形成胀泡。不论是在经典的细胞遗传学时代还是在当今的基因组学时代，多线染色体都为遗传学．尤其是果蝇的遗传学研究提供了不少便利，这种便利是其他一些物种通常所不具备的。双翅目昆虫多线染色体的原位杂交方法可以确定一条RNA或DNA序列在染色体上位置，将许许多多的DNA序列与果蝇的多线染色体进行原位杂交，就可以了解这些序列在果蝇染色体上的顺序，进而拼接出一长段甚至一条染色体的DNA顺序。果蝇的基因组测序就利用了这种方法。而在不具备多线染色体的物种中要拼接DNA序列就困难多了。这就是制备多线染色体至今仍是果蝇遗传学研究的基本技术的原因。唾腺染色体广泛应用于细胞遗传学、发生遗传学、进化遗传学及分子遗传学的研究中。唾腺染色体的制片是研究唾腺染色体的关键步骤，本实验用压片法进行制片观察果蝇的唾腺染色体。2.材料和方法2.1材料、试剂和器材实验材料：果蝇的三龄幼虫。实验试剂：生理盐水（0.9%NaCI溶液）、蒸馏水、1mol/LHCl、45%乙酸、改良苯酚品红染液实验器材：显微镜、解剖镜、两根解剖针（针尖要尖细些好）、载玻片、盖玻片（20mm×20mm）、滤纸条（约0.5mm×3mm）、小毛笔。2.2方法2.2.1三龄幼虫的饲养饲养方法一般遵循以下规则：①培养基富含营养。按果蝇培养基配方配制培养基。在一龄幼虫出现后，每天在培养基表面薄薄地滴上一层用新鲜的酵母或干酵母配成的2%～4%的水溶液，作为幼虫的补充食物，二、三龄幼虫期则滴加10%左右的酵母液；②虫口密度要小。在一新的培养瓶中接种10对左右亲蝇，24小时后即把它们清除，这样就不会因瓶中虫口密度太大而影响幼虫发育；③低温培养。在18～20℃的低温下培养最好，25℃培养也行。2.2.2剥离唾腺要获得好的实验结果，选材是关键。本实验应当选择在培养频壁上胖胖的稍微有些发黄的，身体不动，头时不时微微摆动的三龄幼虫。这种幼虫染色体条带清晰。在一张干净的载玻片上滴一滴生理盐水，用小毛笔从果蝇三龄幼虫培养瓶中选择适宜的三龄幼虫置于载玻片上的生理盐水中。将载玻片置于解剖镜下，取两根解剖针，每只手各持一个解剖针，在解剖镜下进行操作。由于果蝇的唾腺位于幼虫体前1/3～1/4处，所以左手持解剖针按压住虫体前端三分之一的部位，固定幼虫，右手持解剖针扎住幼虫头部口器部位，适当用力向右拉唾腺，腺体随之而出，从而找到唾腺（唾液腺透明，旁边附着黑色细长脂肪）。用解剖针去除唾腺以外的组织，再小心剔除唾腺上的脂肪。剥离清楚的唾腺是肉眼可辨的一个很小的白点，看清这个小点有利于下面的操作。2.2.3解离和染色(1)用HCl解离①解离：在唾腺组织上滴一滴1mol/LHCl，解离2-3min，使组织松软，利于染色体的分散。解离完毕吸去HCl。②水洗：用水冲洗2-3次。前两次每次1－2分钟。用滤纸小心吸去多余的蒸馏水。③染色：滴加一滴（约25微升）改良苯酚品红染液，染色5-10分钟。染色时间不可过长，否则背景也着色。(2)用45%乙酸解离①解离：加一滴45%乙酸30s，用滤纸条小心洗净溶液。②水洗：用水冲洗2-3次。前两次每次1－2分钟。用滤纸小心吸去多余的蒸馏水。③染色：滴加一滴（约25微升）改良苯酚品红染液，染色5-10分钟。染色时间不可过长，否则背景也着色。2.2.4压片染色完成后，将载玻片放在平整的台板上，盖上干净的盖玻片。盖前一定要小心地吸去多余的染料。用干净的滤纸条盖住盖玻片的一角，左手压在滤纸条上按住盖玻片，右手持解剖针用针尖垂直地、螺旋形由中间向四周轻轻地敲击盖玻片，注意不能移动盖玻片（此步骤可在解剖镜下观察）。最后用两层滤纸覆盖在盖玻片上，用两个拇指垂直用力按压，按压时不能让盖片滑动，否则会造成染色体的扭断断裂。2.2.5镜检先用低倍镜进行观察，寻找染色体臂分散良好的标本，找到后将其移至视野中央，换用高倍镜观察染色中心、蓬突、横纹、间纹及根据臂末端特征辨认各条臂。3.结果3.1结果观察图1图23.2结果分析唾腺染色体从染色中心向四周放射状地伸出5长1短的6条臂。染色中心(箭头指向)染色质连接不紧密，横纹结构也不明显。黑腹果蝇的体细胞染色体数是8，其中第Ⅰ染色体（X染色体）是端着丝粒染色体，在形成唾腺染色体时，着丝粒附着在染色中心，另一端游离，仅形成一条臂。这条臂的末端有一个永久性的蓬突；第Ⅳ染色体臂非常短，附在染色中心边缘。第Ⅱ、Ⅲ染色体都是中部着丝点染色体，每条染色体呈“V”形向外伸展出两条臂，形成2L、2R、3L、3R四条臂。这几条染色体最容易辨认的就是4号染色体和X染色体。4号染色体染色体臂非常短，附在染色中心边缘；4号染色体末端有一个永久性的蓬突；其他四条染色体不容易辨认，但是可以通过以下特征加以区分：2L和2R染色体较之于3L和3R染色体末端较窄。2L染色体末端有尖尖的突起，横纹不明显；2R染色体末端横纹明显；3R末端肥大；3L离末端不远处有条带较深的鼓起。也可以根据染色体的长度来判断量量配对的染色体。此次呈现的两张图中，图1染色体臂伸展较开，但是清晰度不足，图2染色体很清晰，但是伸展得不够开，两图可以优势互补。4.讨论（1）多线染色体在许多消化道或消化腺的组织中均存在，但观察多线染色体多用三龄幼虫的唾腺，这是因为唾腺易于剥取且其中的染色体较大的原因。（2）选材时应选择在培养频壁上胖胖的稍微有些发黄的，身体不动，头时不时微微摆动的三龄幼虫。这种幼虫染色体条带清晰。（3）识别唾腺时抓住几个特征：第一，它是上小下大的囊状结构，唾腺旁附着带状的脂肪，在解剖镜下（用侧或顶光源照明）可见唾腺是接近透明的结构，而脂肪常呈黑色；第二，唾腺上的细胞较大，在解剖镜下依稀可见轮廓，放在显微镜的低倍镜上下调焦可清楚地看到；第三，唾液腺较透明，而肠子颜色偏黄并且很长，不要将二者混淆。（4）清除唾腺周围的脂肪组织时要量力而行。（5）剥离唾腺时一定要加生理盐水，否则唾腺易干。不过生理盐水的量不可太多，否则果蝇幼虫会漂浮而且活跃。若生理盐水较多，要在剥离唾腺前吸走一些，但唾腺剥离后不要吸生理盐水，以防将唾腺一起吸走。（6）为了避免用滤纸吸溶液（生理盐水、蒸馏水、HCl或醋酸）时将唾腺吸走，可以用以下方法解决：用滤纸吸去溶液时将载玻片稍倾斜，此时液体顺着载玻片往下流，唾腺则会附着在载玻片上。肉眼辨别唾腺的位置，然后在距唾腺一定距离的下游小心地将液体吸走。（7）滴加一滴（约25微升）改良苯酚品红染液，染色液勿过多，否则压片时唾腺容易随染色液漂走溢出玻片外，同时亦不便于压片的操作，不妨先用一张空白的玻片试验一下留多少染料合适。染色时若染液干了，应再少加些染色液，再慢慢盖上盖波片，避免气泡产生。（8）染色5-10分钟。染色时间不可过长，否则背景也着色并且横纹也会不明显。同时染色时间也不可过短，否则染色太浅横纹也不明显。（9）染料若是有黑色杂质，要在解剖镜下观察杂质是否将唾腺覆盖。如果覆盖了，要小心剖去杂质，尽量不要损害唾腺细胞。（10）敲片时用干净的滤纸条盖住盖玻片的一角，左手压在滤纸条上按住盖玻片，右手持解剖针尖垂直地、螺旋形由中间向四周轻轻地敲击盖玻片，其目的是使细胞分散、染色体平展。在这个过程中要注意不能移动盖玻片，而且要均匀用力、轻敲盖片。敲盖玻片的时候可以在解剖镜下操作，观察染色体散开情况。这一步尤为关键，敲击力度太小染色体展不开，敲击力度过大，染色体会破碎断裂。（11）按压盖玻片时，用两个拇指垂直用力按压，其目的是使染色体的末端展开并且使染色体处在同一个平面上。注意按压时不能让盖玻片滑动。否则会造成染色体的扭曲断裂。