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实验十一IMViC与硫化氢试验指导教师：李海花周六第三组学号：060122010041姓名：宋天佳专业：2010级水产养殖学号：030212010025姓名：皇昊专业：2010级化学1班学号：060122010055姓名：续鹏辉专业：2010级水产养殖一、实验目的了解IMViC与硫化氢反应的原理及其在肠道菌鉴定中的意义和方法。二、实验原理IMViC是I－吲哚（indoltest）、M－甲基红（methylredtest）、V－伏-普（Voges-Prolauertest）和C－柠檬酸盐（citratetest）4个实验的缩写。这4个实验主要用来快速鉴别产气杆菌与大肠杆菌，多用于水的细菌检查。大肠杆菌虽非致病菌，但在饮用水时若超过一定指标，则表示水质受粪便污染。产气杆菌也广泛存在于自然界中，因此检查水是要将两者分开。硫化氢（H2S）实验也是检查肠道细菌的生化实验。（一）吲哚试验（indoltest）吲哚试验是用来检测吲哚试验的产生，有些细菌分解培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色。色氨酸＋H2O色氨酸酶吲哚＋NH3＋丙酮酸吲哚+对二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚（红色）只有部分细菌能产生色氨酸酶，从而具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚实验可以作为一个生化检测指标。大肠杆菌产色氨酸酶实验结果为阳性（红色），产气肠杆菌不产色氨酸酶实验结果为阴性（无色）。（二）M-甲基红试验（methylredtest）用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。细菌代谢糖产生酸使培养基变酸（pH下降），使甲基红指示剂变色：橘黄色（pH6.3）红色（pH4.2）尽管，所有肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但大肠杆菌和产气肠杆菌有区别：两者在培养早期产生有机酸，但大肠杆菌在培养后仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则将有机酸转化为非酸性产物，使pH上升至6左右。因此，大肠杆菌为阳性（红色），产气肠杆菌阴性（黄色）。（三）伏-普实验（Voges-Prolauertest）测定细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物（如丙酮酸）的能力。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，及伏-普反应阳性，不产生红色化合物者为反应阴性。碱性条件、加入少量含胍基的化合物可使反应更明显。大肠杆菌不产丙酮酸实验结果为阴性（无色），产气肠杆菌产丙酮酸实验结果为阳性（红色）。葡萄糖丙酮酸-CO2缩合乙酰乳酸-CO2脱羧乙酰甲基甲醇+OH--2H胍基+二乙酰红色化合物（四）柠檬酸盐试验（citratetest）用来检测柠檬酸盐是否被利用，有些细菌以柠檬酸钠为碳源，培养基中的柠檬酸和磷酸铵被分解后，产生碱性化合物，使pH升高，当加入1％溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基就会有绿色转变为深蓝色，溴麝香草酚蓝指示范围：pH＜6黄色，pH6～7绿色，pH＞7蓝色。大肠杆菌不能利用柠檬酸盐实验结果为阴性（绿色），产气肠杆菌能利用柠檬酸盐实验结果为阳性（蓝色）。（五）硫化氢实验用来检测硫化氢的产生，也是用于肠道细菌检查的常用生化实验。含硫有机物（如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸）能被部分细菌分解产生H2S，H2S和培养基中的铅盐或铁盐反应，形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀。大肠杆菌不能分解含硫有机物实验结果为阴性（无沉淀），产气肠杆菌能分解含硫有机物实验结果为阳性（黑色沉淀）。三、实验器材1、菌种：大肠杆菌、产气肠杆菌斜面各一支。2、培养基：蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、柠檬酸盐培养基、硝酸盐还原培养基、醋酸铅培养基3、溶液和试剂：甲基红指示剂，40％KOH，5％-萘酚溶液，乙醚，吲哚试剂4、仪器或其他用具：试管架，接种环等四、操作步骤一）实验准备1.葡萄糖蛋白胨水培养基配制：蛋白胨3g，葡萄糖3g，磷酸氢二钾1.2g，水600ml，溶解，调节Ph7.，0-7.2，分装于70支试管中，112℃灭菌30min。2.柠檬酸盐培养基配制：NH4H2PO40.2g，K2HPO40.2g，NaCl1g，MgSO440mg，柠檬酸钠0.4g，琼脂4g，调节pH6.8，1%溴香草酚蓝乙醇液2ml，水200ml，溶解，分装于20支试管中，121℃灭菌20min。（pH不宜偏高，以淡绿色为宜）3.硝酸盐还原培养基配制：蛋白胨1.25g，氯化钠0.625g，硝酸钾0.25g，水125ml，溶解，调节pH7.4左右，分装于16支试管中，121℃灭菌20min。4.硫化氢试验养基配制：蛋白胨5g，氯化钠1.25g，柠檬酸铁铵125mg，硫代硫酸钠125mg，琼脂5g，水250ml。先将琼脂、蛋白胨融化，冷至60℃时加入其他成分，调pH7.2左右，分装于35支试管中，112℃灭菌20min。二）接种与培养1.穿刺法分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支醋酸铅培养基（H2S），37℃培养48h。2.分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支蛋白胨水培养基（I）、2支葡萄糖蛋白胨水培养基（M＆V），37℃培养2d。3.划S曲线法分别接种大肠杆菌、产气杆菌于2支柠檬酸盐斜面培养基（C），37℃培养2d。三）结果观察1.H2S实验：观察是否有黑色硫化铅沉淀产生。2.吲哚实验：2d后的培养物内加3～4滴乙醚，摇动数次，静至1～3min，待乙醚上升后，沿管壁徐徐滴加2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物者为阳性反应。3.甲基红实验：2d后的培养物内加2滴甲基红试剂，培养物变为红色者为阳性，黄色者为阴性（注意甲基红不要过量，以免出现假阳性）。4.伏－普实验：2d后的培养物内加5～10滴40％KOH，然后加入等量的5％-萘酚溶液，用力振荡，红色为阳性。5.柠檬酸盐实验：观察2d后的培养物上有无细菌产生及其颜色，蓝色为阳性，绿色为阴性。五、实验结果将实验结果填入下表。“＋”表示阳性反应，“—”表示阴性反应。菌名IMViC试验H2S试验吲哚试验甲基红试验伏－普试验柠檬酸盐试验大肠杆菌++——+产气肠杆菌——+++六、讨论1.吲哚试验、甲基红试验、伏－普试验、柠檬酸盐试验的实验结果与理论结果一致。H2S试验的实验结果与理论结果不一致，两支醋酸铅培养基中都产生黑色沉淀，均为阳性反应，可能的原因：接种操作时，先穿刺接种产气肠杆菌，之后，接种针未充分加热灭菌，再穿刺接种大肠杆菌时混入部分大肠杆菌；接种针在接种产气肠杆菌时，接种针上不粘上了产气肠杆菌，未被加热灭菌，再接种大肠杆菌时，将产气肠杆菌混入，使大肠杆菌产生假阳性反应。2.吲哚试验，实验现象不明显，可能的原因：培养基中的色氨酸含量不够高；吲哚试剂加入的量不够，一部分粘在试管壁上损失掉，之后补加时乙醚已挥发；滴加吲哚试剂时动作不够轻缓，破坏了红色化合物的生成。3.为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏—普试验最初底物和最终产物有何异同？大肠杆菌、产气肠杆菌都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解代谢途径不同。大肠杆菌，可产生乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红，即甲基红反应阳性。产气肠杆菌则使丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏-普阳性反应。4.说明在硫化氢试验中醋酸铅的作用,可以用哪种化合物代替醋酸铅？醋酸铅培养基（试纸）可检验硫化氢的产生，反应为：Pb(Ac)2+H2S=PbS↓+2HAc产生黑色的硫化铅。所以培养基（纸带）变黑为阳性，不变为阴性。从硫离子的角度讲，硝酸银、硫酸铜可产生同样现象。5.为什么在细菌吲哚试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂,而不用丙酮酸？吲哚比较容易检测，特异性也高，不容易受干扰。丙酮酸则相对难以检测，特异性很低，很多反应都能产生丙酮酸，如葡萄糖酵解的终产物也是丙酮酸。