柚果实发育过程中粒化的研究进展

福建农林大学研究生课程考试卷授课时间2012—2013学年度第一学期学号：____1120305011____研究生姓名：______刘志发_______课程名称：果实生长发育与生长物质考试时间：__2013.5.25____考生成绩：___________________授课或主考教师：_________________（签章）柑橘果实发育过程中粒化的研究进展摘要:柑橘是世界第一大水果，粒化现象严重影响了柑橘的商品价值，粒化现象严重影响了柑橘的商品价值。本文综述了柑橘果实发育过程中粒化汁胞的解剖结构和相关生理生化指标的变化,以及导致粒化发生的各种因素和分子生物学方面的研究进展。关键词：柑橘粒化生理生化分子生物学1粒化柑橘粒化是柑橘果实汁胞的生理失调症，柑橘类果实在成熟后期和贮藏期普遍发生汁胞失水变硬、不规则膨大、干枯，颜色变淡，果肉出汁率下降，口感干燥无味，这一生理病害即枯水[1-2]，严重影响了果实的品质。而汁胞粒化是柑橘类果树常见的一种生理障碍，几乎在所有的柑橘种类中都有发生[3]，发生粒化的果实几乎丧失食用价值，严重地影响了其商品价值。对于柑橘汁胞粒化现象，国内外早有报道[4-5]，但其发生的机理仍不清楚，也未有根本的解决办法。本文对柚果实发育粒化现象的发生以及研究进展做一综述，以期为下一步的分子机理研究提供理论参考。2粒化汁胞的结构和生理生化变化2.1粒化果实的结构变化粒化果实一般自囊瓣近蒂端的汁胞先发生，汁胞异常膨大、变硬、木质化、汁味变淡，后渐向果心发展，以果心处长形汁胞最为严重。琯溪蜜柚接近成熟时，一般自囊瓣近蒂端的汁胞先出现异常膨大、木质化，后渐向果心发展，以长形汁胞粒化最严重；采后汁胞进一步枯水，中果皮变得疏松、绵烂，外果皮与正常果无明显区别[6]。张振珏等[7]将琯溪蜜柚汁囊分化和粒化过程分成4个阶段：正常汁囊、凝胶化、粒化、粒化后期；电镜观察表明汁胞粒化是从顶部向基部逐渐发展，汁胞外表面横纹由明显到消失，同时，汁胞细胞壁加厚，高尔基体增加，核体积增大，出现多核仁现象。2.2矿质元素和糖酸含量变化前人报道过结粒化和非粒化果实的植株，其矿物质组成存在差异，叶片和果肉中钙、锌、硼含量与粒化率有关[8,9]。Munshi等[10]报道在Mosambi和红血甜橙粒化过程中，其叶片中氮、磷、钾、镁、锌和铜的含量会升高，而钙、铁、硼的含量会降低，锰的含量不变。粒化植株嫩枝条中的锌、铜含量相对较低，表明两种微量营养元素可能在粒化中起一定作用。此后，他们又继续报道果皮钾和镁的高含量及果肉中氮、磷、钾和钙含量都与红橘的粒化高发生率有关[11]。Awasthi等[8]认为，总可溶性固形物和单糖的含量降低可能是由于从聚合多糖向可溶性碳水化合物的转化受到抑制，淀粉或水溶性碳水化合物（TSS和单糖）在粒化果实中转化为聚合多糖。他们还报道，在甜橙中酸度下降和汁液pH升高会引起粒化的发生，而在粒化的汁胞中，在短期内抗坏血酸的含量下降，但在成熟后期它的含量最终增加。从而认为可滴定酸与果实汁胞的粒化率和粒化程度呈负相关，而汁液的pH与果实粒化直接相关。王向阳[12]用同位素示踪表明椪柑粒化果的可溶性物质大量转化为不溶性物质，认为粒化过程细胞壁加厚主要是细胞壁合成和合成物质吸附造成的。2.3生理变化胡西琴等[13]对椪柑和温州蜜柑贮藏果实汁胞枯水发生过程中乙烯含量、呼吸强度进行研究，表明粒化过程果实所含糖和有机酸作为呼吸底物被消耗，果实趋于衰老，同时果实的呼吸强度随粒化加重而增大。王向阳等[14]对粒化椪柑果皮和果肉的呼吸强度进行测定，均高于正常果，对相对含水量、自由水含量、水势、势测定表明粒化果均高于正常果，只是出汁率显著下降。Burns等[15]在Florida研究了几种不同柑橘种的粒化和非粒化的汁囊内的耗氧量和糖苷酶代谢情况。从刚收获的新鲜橘柚、贮藏Dancy蜜柑和马叙柚子中分离出的正常汁囊耗氧量很低，但是粒化的汁囊的耗氧量却是它的2～3倍。随着葡萄柚粒化程度的加重，耗氧量也会随着增长。类似的，粒化组织中的糖苷酶的活性也是原来的2～3倍。他还推测，呼吸速率提高产生的ATP可能提供能量用于合成细胞壁，耗氧量的增加和糖苷酶的活性与观察到的柑橘属枯水症状有很强的相关性。2.4酶活性变化2.4.1水解酶类针对粒化果汁胞出现凝胶化、木质化、细胞壁加厚现象，前人研究发现随着果实粒化程度加重，粒化汁囊的总干重、半纤维素（如木糖）、纤维素（如葡萄糖）和木质素含量与非粒化的果实相比有明显增长。Hwang等[16]对马叙葡萄柚的研究还证实，粒化的汁胞与健康的汁胞的果胶质和半纤维素的分子组成成分分布没有明显差异。这说明，汁胞的粒化并非有新的代谢途径在左右着该过程，而是自身的代谢方向可能被改变。果胶是植物细胞壁的重要组成成分，果实成熟时，在半乳糖醛酸酶作用下，细胞壁上的果胶分解成可溶性果胶，细胞彼此分离，果实变软[17]。粒化汁胞在成熟过程中却凝胶化、少汁、变硬。目前，对果胶甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶在植物中的酶学活性研究已有很多报道。果胶甲酯酶的浓度被认为是决定果实粒化与否的一个重要因素。在柑橘中，随着果实的成熟，果胶甲酯酶的活性逐渐下降。在表现出稍微粒化的Kinnow柑中，果胶甲酯酶的活性比其他两个品种（考拉宽皮橘和凤梨橙）稍微高些[18]。果胶甲酯酶的浓度被认为是决定果实粒化与否的一个重要因素。Hwang等[19]对马叙葡萄柚汁胞的生化成分进行分析，结果表明，粒化的汁胞与健康的汁胞在果胶质、半纤维素的组分分布上没有明显差异，但粒化汁胞中结构多糖类(果胶、纤维素、半纤维素等)的含量比正常汁胞高出2倍多，水溶性果胶、螯合溶性果胶和纤维素、半纤维素片段的离子交换层析谱则与正常汁胞的不同，这一结果说明了汁胞的粒化并非有新的代谢途径在左右着该过程，而是自身的代谢方向可能被改变；Singh等[20]报道，粒化与果胶甲酯酶的活性呈负相关，粒化程度高的Kaula宽皮柑橘的果胶甲脂酶活性最低；Chakrawar等[21]也报道粒化果实的果胶甲酯酶活性比正常的低，并认为果胶甲酯酶与粒状化有关；El-Zeflawi[22]、谭兴杰等[23]究表明枯水过程中，果胶酶的多种酶活力加强，代谢活动加强了导致枯水。佘文琴等[24,25]研究了细胞壁代谢在琯溪蜜柚果实成熟期间汁胞粒化发生中的作用。在汁胞粒化发生过程中果胶甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶的含量都比较低。果胶甲酯酶(PE)活性在成熟阶段前中期PE活性呈下降趋势，在9月28日出现PE活性高峰后快速下降，汁胞PG前中期活性较低，9月18日后的变化趋势和PE活性的变化一致。粒化汁胞的纤维素，原果胶含量均高于未粒化汁胞；它的PE活性，PG活性低于未粒化汁胞。此外，Burns[26]测定了葡萄柚α－半乳糖苷酶、β－半乳糖苷酶、α－葡糖苷酶、β－葡糖苷酶活性，粒化汁胞高于正常和β－甘露糖苷酶活性在正常汁胞中没测到，但在粒化汁胞中达很高水平，认为这些糖苷酶的活性可能与细胞壁加厚有关。2.4.2自由基代谢相关酶类果实的成熟是一个衰老的过程，许多参与自由基代谢的酶与柑橘果实的粒化有关。活性氧代谢与柑橘类果实汁胞粒化的关系也有报道，主要认为果皮或果肉中较高水平的POD可能与果实枯水有关，陈昆松等[27]认为果皮或果肉中较高水平的POD可能与胡柚果实枯水有关，周春华[28]等认为对柑橘温度预处理引起的POD活性的上升可能与提高果皮木质素含量有关，曾顺德等[29]通过研究发现，A一型保鲜剂有利于维持SOD、POD等酶的活性，使之在果肉中后期仍有较高活性，同时降低POD同工酶和纤维素酶的活性，延缓组织实衰老，减轻汁胞粒化的发生程度。但活性氧代谢和柑橘汁胞粒化木质化的机理仍没得到解释。2.4.3内源激素与生长调节剂席屿芳等[30]报道枯水果果皮的CTK和IAA含量较低，ABA含量较高；但陈昆松等[31]报道枯水果队A含量上升；王向阳等[12,14]对粒化枯水桠柑果皮和果肉的ABA含量进行测定，均显著高于正常果；桠柑果实贮藏期达三个月时，果皮中ABA的含量和乙烯的变化明显增加。当开始出现粒化阶段，ABA的浓度增加到19.0％，而乙烯的浓度达到15.5％。当粒化明显时，ABA的含量增加到36.6％，而乙烯的含量增加到52.8％，这说明了果实的粒化与ABA含量的增加和乙烯的增加是有直接关系的。陈昆松等[27]、陈秀伟等[32]用GA，处理柚果可增加POD活性，推迟果皮中峰值出现，降低粒化指数。使用生长调节剂调控粒化发生也说明汁胞粒化与内源激素有密切关系。潘东明等[33]杂交试验结果表明，琯溪蜜柚杂交产生的有子果实几乎无汁胞粒化发生，而无子果实粒化发生严重。此外，通过使用生长调节剂能调控粒化的发生也说明汁胞粒化与内源激素有密切关系[34]。3汁胞粒化的成因目前还没有关于柑橘汁胞粒化产生的具体原因的报道，只是发现了很多可能与之相关的因素。3.1外界环境因素Singh[35]和Ritenour等[36]认为气候和地区差异对柑橘汁胞粒化的发生有影响，春季盛行的高温容易导致粒化症状的发生，生长在潮湿气候下的柑橘粒化发生率要高于干燥地区，沿海地区的柑橘粒化症状也比内陆地区更为严重。3.2种和品种及树种特性Sharma等[37]认为柑橘不同种及同一种内的不同品种的粒化发生率和范围有所不同，同品种会因时间、地点不同而对粒化的反应也不同。甜橙比宽皮柑橘、橘柚和葡萄柚更易粒化，考拉和Dancy宽皮橘也易发生粒化，Kinnow是最不易受影响的。3.3砧木Sharma等[37]认为不同的砧木影响芽接在其上的不同属种柑橘栽培种粒化的发生率和程度，按粒化的严重情况由低到高依次为酸橙、Sevelle甜橙、粗柠檬和野葡萄柚。4分子生物学在粒化方面的研究近年来，分子生物学手段逐渐被应用到了粒化的研究当中，佘文琴[38]利用差异显示技术研究琯溪蜜柚汁胞粒化过程中粒化和未粒化汁胞基因的表达，得到了25个差异cDNA片段，并从其中的两条EST获得cDNA全长。钟凤林[39]利用双向电泳技术分析果实发育阶段粒化汁胞和非粒化汁胞的蛋白差异表达，获得50个差异蛋白点，发现Germin基因和APX基因与汁胞粒化相关。潘腾飞等[40]构建了琯溪蜜柚的BAC文库，通过已知的EST序列设计引物筛选出了与多铜氧化酶基因和果胶酯酶基因具有较高同源性的2个序列。Ding等[41]的研究获得了6株果实汁胞粒化现象严重而且稳定的突变体植株，并以其为材料，从生理和生化方面研究了两者在整个果实生长发育阶段的细胞壁组分以及代谢的变化，结合SSH，反向Northern，Real－timePCR等技术从转录水平研究其基因的表达差异，并揭示了调控粒化形成可能的分子途径[42]。5小结总之，柑橘类果实粒化的机理可能与以下几个方面有关：营养物质过度消耗导致粒化；粒化过程中，果胶酶活性加强，果胶酶的多种酶活力加强，整个代谢活动加强了导致枯水；柑橘果皮早衰导致枯水；果皮组织存在第二次生长：以及枯水过程中活性氧代谢、生长调节剂、内源激素和矿物质失调。而粒化过程伴随的凝胶化、木质化现象之间的原因还有待进一步探讨。目前，甜橙二倍体和克里曼丁单倍体基因组测序已经完成，可用作参照基因组进行读谱，能获得更多注释基因的表达调控信息；同时能够在全基因组范围内检测汁胞中广泛存在的可变剪切现象，进行粒化汁胞转录本的结构、基因转录水平和全新转录区域研究，能为最终阐释柑橘果实粒化现象提供分子依据，以期能从分子育种的角度彻底解决柑橘汁胞粒化这一难题。参考文献[1]HWANGYS,HUBERDJ,ALBRIGOLG.Comparisonofcellwallcomponentsinnormalanddisorderedjuicevesiclesofgrapefruit[J].JAmerSocHortSci,1990,115(2):281-287.[2]孔维娜,刘顺枝,李小梅,等.柑橘类果实枯水机理及防治研究进展[J].热带亚热带植物学报,2010,18(4):453-458.[3]BurnsJK,AlbrigoLG.Granulationingrapefrui