柱层析技术

柱层析技术实验目的：熟练掌握柱层析技术。实验原理：色谱法分离的原来就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。柱层析技术又称柱色谱技术，主要原理是根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离开来。柱层析操作时，先在圆柱管中先填充不溶性基质，形成一个固定相。将样品加到柱子上，用特殊溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离。Rf=距离溶剂前沿到原点中心的点中心的距离溶剂最高浓度中心到原三实验内容：1、装柱方法湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加压用淋洗剂“走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡。干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度，最后再用油泵抽，这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂“走柱子”，一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。干法装柱较方便，但最大的缺陷在于“走柱子”时，由于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚，二氯甲烷更为明显。2、上样方法上样也有干法和湿法之分：干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦，但可以保证样品层很平整。实用于溶解性差的样品。湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入。优点：简便3、实验步骤：（1）点板检测，确定展开剂比例和装柱淋洗剂比例（2）装柱，根据所过产物的量进行适量的调整，例如装柱柱子大小，所装柱子高度，饱和溶剂的选择。（3）上样。所上样品的量，以及加入溶解样品的溶剂方面都需要注意。（4）待样品进入完全，再用少许溶剂清洗2-3次，大约0.5ml/次。（5）加入淋洗剂进行过柱分离。（6）点综合板进行检测，观察那些物质有点。再对有点的进行检测。紫外或者碘显都可以。4、实验结果图1图2图3图4图5说明：1、图1为综合板，在12管开始出现样点，在16点结束，17点消失；2、图2左为11管样点，中为12管样点（样品出现），右为样品；3、图3左为16管样品点，中为17管样（样品已消失），右为样品点；4、图4为综合板，在27管出现样品点，在44管结束，45管消失；5、图5左为26管样点，中为27点样点（样品点出现），右为样品点；6、淋洗剂为PE:EA=10:1过第一个样点，PE:EA=7:1过第二个样点。