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项目类别申报学科代码1科学编号CC03030402国家自然科学基金申请书项目名称：CDK5及其抑制剂P27Kip1在胚胎神经管缺陷发生中作用的研究申请者：所在单位：邮政编码：通讯地址：电话：传真：申请日期：2002.3.国家自然科学基金委员会一九九七年制填报说明一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办法及规定。申请书各项内容，要实事求是、逐条认真填写。表达要明确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现的缩写词，须注出全称。二、申请书为十六开本，复印时用B5复印纸、于左侧装订成册。第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式六份(至少一份为原件)，由所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国家自然科学基金委员会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省(自治区)科委一份原件。三、封面右上角“科学部编号”由于对口科学部填写，项目类别和申报学科代码1由申请者填写。四、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请(含参加)的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数(不含重点项目、重大项目)，不得超过两项。五、同一项目组研究内容相近的项目，只允许报送一个科学部。六、申请者可因同类项目竞争等原因，提出不宜评议本项目的专家名单(姓名与单位，3人以内)，附另页于申请书原件中，供科学部选择同行评议人时参考。科学部将对此信息保密。七、国家自然科学基金委员会通讯地址：北京市海淀区花园北路35号东门邮政编码：100083一、简表研究项目名称中文CDK5及其抑制剂P27Kip1在神经管缺陷发生中作用的研究英文Astudyofroleofcyclindependentkinase5andtheinhibitorp27Kip1invovledinthedevelopmentofneuraltubedefects类别A.自由申请B.高技术探索C.青年D.地区E.重大F.重点H.专项高技术探索项目主题号C申报学科名称1产科学名称2发育神经生物学A.基础研究B.应用基础代码1C03030402代码2C010606A申请金额20.30万元起止年月2003年1月至2005年12月所用实验室A.国家重点；B.部门开放；实验室编号申请者姓名中文性别A.男B.女出生年月1969.5民族名称汉族拼音B身份证号193270690518882代码01专业技术职务名称讲师学位A.博士B.硕士C.学士博士学位授予国别或地区国(地区)名中国A院士B.博士生导师代码013A代码156C.博士后名称第三军医大学系(所)基础部单位代码63003801所在单位性质A.高等院校B.硕士邮政编码400038隶属关系名称中国人民解放军C.学士A申请者电话(023)68752231代码800所在地省(自治区、直辖市)重庆市(县)沙坪坝区高滩岩街(路)30号项目组总人数高级中级初级博士后博士生硕士生参加单位数51311主要成员◠不含申请者◡姓名身份证号专业技术职务所在单位名称及代码项目中的分工签字193270680509881讲师第三军医大学63003801基因转染193270710721881讲师第三军医大学63003801数据分析肖燕193270760425882助教第三军医大学63003801全胚培养孙榆193170560212882高级技师第三军医大学63003801原位杂交—1—研究内容和意义摘要应用全胚培养技术结合DNA芯片、流式细胞仪、原位分子杂交及基因转染等手段，检测正常及神经管缺陷(NTD)小鼠胚胎细胞周期调控因子的表达差异；并观察CDK5的表达及分布；分析增强其抑制因子P27Kip1的表达后对NTD发生率的影响。为揭示NTD发生之谜提供实验依据，为NTD的早期诊断和预防提供新的线索。主题词1.主题词数量不多于三个；2.主题词之间空一格（英文用/分隔）中文CDK5神经管缺陷(NTD)全胚胎培养英文CDK5/neuraltubedefect(NTD)/wholeembryoculture简表填写要求一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新发布的《国家自然科学基金申请项目分类目录及代码》为准填写。高技术探索课题主题号按《高技术新概念新构思探索课题项目指南》中主题号填写，早请其重点项目时项目时项目类别也填写B，并在申请书封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。二、凡选择性栏目，将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。三、部分栏目填写要求：项目名称——应确切反映研究内容和范围，最多不超过25个汉字(包括标点符号)。基础研究——指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑用目标的研究活动。应用基础研究——指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。申报学科——申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两项,先填写两项,先填为主学科。申请金额——以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。起止年月——起始时间从申请的次年1月算起。完成时间为完成年度的12月。所用实验室——系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的开放实验室。所在单位名称及代码——按单位公章填写全称，例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填“中科院西安学机所”或“西安学机所”。全称中的数字，一律写中文，例如：中国航天工业总公司第七0一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未编入单位代码，其代码暂不填写。参加单位数——指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位(合作者所在单位)，以阿位伯数字表示。项目组主要成员——指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析对项目的完成起重要作用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。研究内容和意义——摘要与主题词均录入软盘。—2—二、立论依据(包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处)对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述基应用前景。神经管的发生是建立中枢神经系统原基的重要胚胎学事件，是指从神经板出现到神经管关闭的发育过程。在此过程中，神经板必须准时准确地关闭形成神经管,神经系统才得以正常发育,否则将出现神经管缺陷（neuraltubedefect,NTD）和随之而来的脊柱裂、脑暴露、无脑等常见畸形。NTD的发病率在世界范围内占出生婴儿的1-9/1000，给家庭和社会带来了严重负担。由于哺乳类胚胎在植入子宫后所致的不可接近性，阻碍了对神经管发育的直接实验研究和连续监测，至今对NTD的发生机理尚缺乏足够认识，对NTD早期诊断和防治也缺乏有效手段。研究发现，神经管的发生、关闭受多种内、外在因素的调节。多种体内单基因如F52、转录因子Ap-2及Sp基因等的突变或缺失，可造成胚胎NTD发生[1]。神经管邻近组织的生长缓慢、神经上皮异常或神经褶形态受损等等许多神经管发育进程的改变也直接导致NTD的发生[2]。神经管的发育正常化必须遵循生长、退化同在，增殖与死亡并存，二者处于和谐的动态平衡中。近年大量的研究表明NTD发生时Bcl-2等凋亡相关基因的改变可引起神经褶细胞凋亡过度，提示细胞凋亡的错误调节是NTD发生的一个重要原因[1、3]。已有文献提示细胞凋亡的发生与细胞增殖调控密不可分[4]。对维甲酸(RA)诱导的小鼠NTD模型的研究表明RA既可引起神经管腹侧大量细胞的凋亡，同时也改变了神经上皮细胞的增殖速度[5]。对砷中毒引起的NTD的研究提示NTD的发生是细胞正常增殖受到抑制所致[6]。此外，一些来自神经管外部的因素同样会造成细胞增殖缺陷，从而造成NTD的发生。因此细胞增殖调控因子的错误调节无疑参与了NTD的发生[7]。研究NTD发生过程中细胞增殖调控因子的作用，将有助于进一步了解NTD的发生机制。细胞增殖的启动与进程受到严格调控，参与调控的因子包括起正调控作用的细胞周期素（cyclin）和细胞周期素依赖性激酶家族（CDKs）基因产物，结合成cyclin-CDKs复合物才能发挥激酶活性。同时，CDKs的活性还受其抑制物（CDKIs）的负调节，包括Ink4家族(p15Ink4b，p16Ink4a，p18Inka，p19Ink4d)和Cip/Kip家族(p21Cip1，p27Kip1，p57Kip2)，其中p21Cip1及p27Kip1家族抑制CDKs的多种类型。新近的研究表明，不同的cyclin-CDKs复合物在神经管发育过程中对神经上皮细胞的增殖调控不同：D型-cyclin-CDK4或CDK6是协助细胞通过G1期所必需的；cyclinE-CDK2能促进细胞进入S期；cyclinA-CDK2则使细胞通过S期[8]。降低cyclinD1激酶的活性，可引起大鼠小脑发育停滞。研究还发现NTD发生时G0/G1期细胞比例大大增多，G1期延长，降低了细胞增殖速率[9]等等。可见CDKs家族在一定程度上参与了神经管早期发生的调节，然而，诸多细胞增殖调控因子（正、负调控等）在NTD发生中是如何协同作用，目前国内外尚未有相关研究报道，近年来新出现的DNA芯片技术为我们从整体水平研究参与神经管及NTD发生中的细胞增殖调控因子—3—的表达全貌提供了一个良好的技术平台。所得结果将对揭示NTD的发生有重要的理论意义和应用前景。神经系统发育中细胞增殖调控因子的作用不仅仅是调节神经细胞的增殖，也参与神经系统的发育、分化及重塑。对细胞周期依赖激酶抑制因子p27Kip1的研究结果证实了这一观点。如胚胎晚期及新生期小脑内p27Kip1蛋白表达逐渐增多可抑制发育中神经元和胶质细胞的增殖，诱导神经细胞分化[6]。而p27Kip1的表达被封闭后则可阻断神经元的分化，在Ink4和Cip/Kip缺陷小鼠脑内许多区域可见静止的、已分化的成熟神经元出现分裂，并伴运动迟缓症、本体感受异常、癫痫发作及生后早期死亡[7]。CDK5，作为CDK家族的成员之一，在神经系统发育分化中有很大的特异性。CDK5可存在于非分裂的神经元，其特异的激动剂为一种分子量为35kDa的神经特异蛋白P35。研究表明CDK5/P35可通过调节神经细胞微管相关蛋白MAPs如Tau蛋白的活性及细胞骨架蛋白如nestin的磷酸化而促进发育中神经细胞的迁移、轴突生长、粘连和细胞骨架动力学等。CDK5基因突变或失活则轴突的伸长及导向受抑制[11]。CDK5（-/-）小鼠表现为中枢神经系统从大脑皮质到脑干的发育异常，颗粒细胞保持在分子层，不迁移到颗粒细胞层，小脑蒲肯野细胞分布异常等[12]；单纯P35（-/-）小鼠出现严重的皮质分层缺陷，部分小鼠患癫痫等症[13]。故认为CDK5/P35共同参与皮质发育中的神经元迁移、轴突生长和神经退行性变，并调节神经元的粘连和细胞骨架动力学[14]。然而，NTD发生时神经细胞的分化和迁移情况怎样，CDK5是否参与了NTD的发生，至今未见国内外报道。因此，研究NTD发生后CDK5的时空分布特征，可间接获取NTD发生时神经细胞的分化和迁移的资料。此外，研究CDKs的作用不可避免地要涉及到对其抑制因子的研究。已有的资料发现胚胎晚期及新生期小脑内p27Kip1蛋白表达逐渐增多可抑制发育中神经元和胶质细胞的增殖，诱导神经细胞分化[15、16]。用反义核酸技术封闭并抑制p27Kip1的表达可阻断神经元的分化[17]，在Ink4和Cip/Kip缺陷小鼠脑内许多区域可见静止的、已分化的成熟神经元出现分裂，并伴运动迟缓症、本体感受异常、癫痫发作及生后早期死亡[18]，提示p27Kip1参与了神经细胞的分化，对维持神经系统功能的稳定性有重要作用。鉴于已知NTD发生与细胞增殖受到抑制有关，增强抑制因子p27Kip1的表达对正常神经管发育有何影响，是否有NTD的发生，神经系统的稳定性是否改变等均值得进一步研究。本课题立项是在前一自然基金课题（No:39970768）研究的基础上进一步提出的。拟应用RA诱导致NTD模型，结合体外全胚胎培养技术，首先运用目前