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科技发展基金申请书项目名称：反义MMP-2治疗溃疡性结肠炎的实验研究申请人：所在部门：申请日期：一、简表研究项目课题名称反义MMP-2治疗溃疡性结肠炎的实验研究研究类别基础研究（√）应用研究（）开发研究（）1申请金额4.５万元起止年月2003年1月至200412月申请者姓名性别出生年月从事专业专业技术职务工作部门出国时间无回国时间无最终学位学士授予国别中国联系电话个人主要简历（本科毕业后学习工作情况）项目组主要成员姓名性别出生年月技术职务工作部门年参加月项目分工教授6总设想、指导副主任医师／博士6免疫组化硕士研究生8动物模型／反义合成硕士研究生6RT-PCR硕士研究生6病理染色二、研究内容研究内容和意义，国内外现状分析近年来溃疡性结肠炎（UC）的发病率不断升高，其治疗方法的探索一直是UC的研究重点。UC发病的四大因素中免疫因素占了主要地位，目前公认的观点是UC是肠道免疫炎症性疾病。但在具体的免疫机制中若干细节问题远未解决，如细胞因子在UC中的具体调节作用；炎性介质和氧自由基参与免疫反应的调节机制等[1]。临床表现上UC有炎症细胞的浸润、上皮细胞增生，并伴有上皮下组织重构并导致细胞外基质成分2（extracellularmatrix,ECM）的降解。而ECM的降解主要是基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinas，MMPs）完成，MMPs受到多种细胞因子刺激后几乎可被所有的连接组织细胞释放。近来在研究有关ECM合成和降解的代谢平衡调解中，引人注目的是基质金属蛋白酶（MMPs）和金属蛋白酶组织抑制因子（tissueinhibitorofmetalloproteinases，TIMPs）两个酶系统的作用。MMPs是ECM的降解酶，TIMPs则是MMPs的特异性抑制剂。当ECM的降解程度大于合成程度时，将导致组织器官的损伤,如UC溃疡形成。自1962年Gross和Lapiere首次报道胶原酶(Collagenase)以来，作用于ECM其它成分的基质金属蛋白酶不断报道。到目前为止已发现和纯化的MMPs至少有24种[2],已证实MMPs在几乎机体各种组织的发育和修复、肿瘤发生发展、炎症反应等过程中发挥着重要的作用。MMPs根据其结构和底物特异性不同可分为5大类：（1）间质胶原酶，包括MMP-1、-8、-13、-18，（2）Ⅳ型胶原酶，也叫明胶酶，包括明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)。明胶酶具有降解变性Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原明胶的特异能力，也可切割天然Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ型胶原。对纤维结合素、弹性蛋白也有一定作用。MMP-9(Mr=92×103)是糖化蛋白酶，主要来源于中性白细胞和巨噬细胞。MMP-2(Mr=72×103)是非糖化蛋白酶，来源于许多结缔组织细胞；（3）基质溶解素，包括基质溶解素-1(MMP-3)、基质溶解素-2(MMP-10)和基质溶解素-3(MMP-7)；(4)膜型MMPs，包括MT1-MMP(MMP-14)、MT2-MMP(MMP-15)、MT3-MMP(MMP-16)以及MT5-MMP。这种酶表达于细胞表面，除可直接降解基质，还对MMP-2和MMP-13有激活作用；(5)其它类，包括MMP-4、-5、-6、-20。MMPs有一些共同的生化特点：不同细胞来源的MMPs有很高的同源性；激活后的酶可裂解一种或多种细胞外基质成分；酶的活性可被MMPs的天然抑制剂TIMPs抑制；多数MMPs基因转录受到内源性生长因子和细胞因子调节，如IL-1和IL-6、TNF-α、TGF-α和IFN-γ以及BMP等[2]。MMP－2及MMP-9属Ⅳ胶原酶，而Ⅳ胶原酶是基底膜的主要成分，故它们可以降解细胞外基质。此过程在肿瘤的浸润和转移方面得到了广泛的关注，如已经了解到细胞外基质和基底膜是肿瘤生长和扩散的基础屏障；金属蛋白酶及其抑制剂是ECM代谢的主要调节者；MMPs降解ECM和BM（BasementMembranes）与肿瘤的浸润和转移密切相关[3],MMPs高表达的肿瘤，浸润性和转移性强[4]；MMPs在肿瘤组织中表达具有组织特异性和受多基因调控。但在其参与UC的免疫炎症致病过程知之甚少。同时虽然理论上金属蛋白酶组织抑制因子不仅能抑制金属蛋白酶的活性，而且具有抑制肿瘤血管生成作用，并已经作为一个有前途的抗肿瘤生长和转移的药物进行了临床试验。但随着TIMPs抗肿瘤(成胶质细胞瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌等)的第三阶段实际试验结果令人失望，更多的有关MMPs和TIMPs的研究将转向早期阶段性疾病上,如UC的溃疡形成机制和防止UC恶变[5]。在UC的治疗上目前有明确疗效的有：SASP、肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素、化疗药等，但不同的病人疗效不一。随着分子生物学的发展，反义治疗治疗UC已经成为可能。1978年Zamecnik等首次报道反义寡核苷酸(antisenseoligodeo-xyribonucleotide,AS-ODN)可抑制劳斯肉瘤病毒(RSV)的复制。20年来，大量研究证实了AS-ODN特异性抑制基因表达的能力，通过与mRNA上特定的靶序列互补或“反义”，AS-ODN可阻断mRNA翻译，调节由基因到蛋白质的信息传递，抑制蛋白质表达。其实质为通过碱基配对，AS-ODN与靶mRNA上的特定序列杂交，以基因作为靶点抑制蛋白质的表达。反义寡核苷酸阻断基因表达的作用机制目前尚未完全明了，人们对其作用机理提出了各种假设：与pro-mRNA外显子和内含子拼接位点之间结合抑制拼接反应；与翻译抑制密码子结合，通过一种直接的空间效应阻断核糖体与mRNA结合及翻译起始；以起始密码子下游编码序列为靶点，抑制核糖体在mRNA上的延长及转位；RNaseH是一种普遍存在的酶，识3别双链mRNA-ODN结构并裂解mRNA链［6］。本课题组通过动物模型和体外干预试验二方面进行MMPs和TIMPs的表达与UC的关系的研究，探讨其机制，并为进一步了解UC的发病机制和治疗研究奠定基础。参考文献1MonteleoneI,VavassoriP,BianconeL,MonteleoneG,etal.Immunoregulationinthegut:successandfailuresinhumandisease.Gut2002;50Suppl3:III60-642AStallmach,CCChan,K-WEcker,etal.Comparableexpressionofmatrixmetalloproteinases1and2inpouchitisandulcerativecolitis.Gut,2000;47(3):415-4223NewellKJ,MatrisianLM,DrimanDK.Matrilysin(matrixmetalloproteinase-7)expressioninulcerativecolitis-relatedtumorigenesis.MolCarcinog2002;34(2):59-634ArihiroS,OhtaniH,HiwatashiN,ToriiA,SorsaT,NaguraH.VascularsmoothmusclecellsandpericytesexpressMMP-1,MMP-9,TIMP-1andtypeIprocollagenininflammatoryboweldisease.Histopathology2001;39(1):50-595VonLampeB,BarthelB,CouplandSE,etal.Differentialexpressionofmatrixmetalloproteinasesandtheirtissueinhibitorsincolonmucosaofpatientswithinflammatoryboweldisease.Gut2000;47(1):63-736LouisE,RibbensC,GodonA,etal.Increasedproductionofmatrixmetalloproteinase-3andtissueinhibitorofmetalloproteinase-1byinflamedmucosaininflammatoryboweldisease.ClinExpImmunol2000;120(2):241-246拟采取的研究方法、技术路线、实验方案、可行性分析及拟解决的关键问题研究方法1.冰醋酸刺激法取SD大鼠250±50g，♂♀兼用，禁食24h后，以2%戊巴比妥钠溶液作腹腔麻醉(30mg/kg)，0.5%肥皂水灌肠。制备0.3×0.3cm2棉花纸浸沾10%冰醋酸(或用5%冰醋酸0.2～0.3mL直接直肠注入)通过细橡皮管道送入距肛门5～6cm处，间隔2天重复进行一次，连续34次，于第8天处死动物，取出结肠和直肠观察，可见溃疡形成。2.非特异性ASODN和特异性ASODN（由中科院生化所提供）及阳性药物分别干预10支UC模型。干预方式为50mg/kg,连续3次,2天一次灌肠。阳性药物以标准剂量进行。3.干预后，在第1周处死动物，并分别取血和肠组织标本进行检测。用ELISA法检测血清层黏连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原肽(PⅢP)、透明质酸（HA）等。肠标本行病理切片观察炎症情况,用免疫组化、RT-PCR分别检测LN、I及III型胶原的基因和蛋白质表达水平。从而探讨反义MMP-2在UC中的治疗作用，为进一步研究UC的治疗奠定基础。研究内容1）建立SD大鼠UC模型；2）观察反义MMP-2治疗SD大鼠实验性UC的疗效及其5氨基水杨酸灌肠效果的差异。5重点解决的问题:1）UC动物模型的建立；2）特异性反义寡核苷酸（ASODNs）的人工合成；3）ASODNs如何干预UC动物模型及指标的检测；正常对照(１0只)给予NS阴性对照组(10只)给予非特异性ASODN阳性对照组(10只)给予5氨基水杨酸实验组(10只)给予特异性ASODN模型对照组(10只)给予NSSD大鼠50只SD大鼠(40只)制备UC动物模型每2天给药1次，２W后处死大鼠，取血和肠黏膜标本，用同时行组织病理检查、ELISA法、免疫组化法及RT-PCR法检测血清LN、PIIIP、HA含量、组织病理学变化及I型和III型胶原基因和蛋白表达综合分析实验数据；判断ASODNs抗UC的疗效。撰写学术论文，进行成果鉴定6与本项目有关的研究工作积累和已取得的主要研究工作成绩多年以来,我们一直致力于消化道粘膜疾病发病机制和防治的研究。尤其是近年来我们对p53,p16抑癌基因,多药耐药基因(MDR1)、多药耐药相关蛋白基因(MRP)、GST-π,MUC-1、VEGF、u-PARmRNA等在食管、胃、大肠癌组织、癌旁组织中的表达进行了系统的研究。1985年以来先后承担省部级课题6项,其中有一项铁道部课题正在进行：粘蛋白基因（MUC-1gene）在胃癌中的表达和意义（项目编号：J2000Z123）；先后发表论文30余篇,其中主要有：预期研究进展、成果和考核指标预期研究进展：2003.1～2003.6：UC动物模型的制备、购买试剂；2003.6～2003.12：反义寡核苷酸的合成（ASODN）包括特异和非特异性反义片段；2004.1～2004.4：以MMP-2的ASDAN和艾迪沙灌肠干预UC，检测指标，并进行比较；2004.5～2004.12：总结试验结果、撰写论文结题。预期成果和考核指标:1）探讨反义MMP-2治疗UC的可能及作用机制，为进一步临床运用打下基础；2）作为系统研究的基础,申请更高级别课题，申报科研成果奖；3）发表论文3~5篇。已具备的实验条件、试验设备、技术力量1）胃肠黏膜疾病研究是我科的特色，对其发病的机理和治疗研究有较深的基础；2）反义治疗涉及基因治疗的分子生物学知识是21世纪现代医学的努力方向；3）本科室高级专业技术人才较多，基础理论和知识更新率较快；三、经费预算支出科目金额（万元）计算根据及理由科研业务费0.2文献检索入网费;文献资料购买费实验材料费4.1.SD大鼠50只及饲养2000元MMP-2反义