标准曲线探讨

任何一个色谱方法都需要有标准曲线来建立定量的标准。我们经常讨论有关这方面的问题。但是我们似乎也对这个课题可能没有全面的了解。我不是危言耸听，而事实的确存在。我觉得实在有必要把标准曲线的来龙去脉说个清楚。也希望同行们能够不吝指教。毕竟每个人看法，想法，做法多少都会有出入的。就算我来个抛砖引玉吧。当然，首先我们必须有一个固定的色谱方法，这个方法是以等度色谱为主。重点只是检验主成分。条件是进样量要小，然后走样的时间不超过10分钟（越短越好）。因为进样量小，所以可能出现的杂质或有关物质，我们都无法看到。然后开始看看我们的标准曲线。一般标准曲线的范围是根据我们要分析的靶点浓度(targetconcentration)来决定。也就是在我们对某一样品进行分析的时候，所采用对照品的浓度。因为我们没有必要在每次分析的时候，都连续进样不同浓度的对照品，建立标准曲线，然后从标准曲线来求得样品的浓度。但是当我们用单一靶点浓度来定量的时候，我们是需要使用标准曲线来检验单一靶点浓度来定量的可行性。那我们如何来决定对照品的单一靶点浓度呢。首先我们使用对照品来决定QuantitationLimit(定量限)及DetectionLimit(检测限)。在这里我要强调的就是假设我们要定量主成份（不是杂质或相关物质），因此我们强调的是准确度(precision)及精确度(accuracy)。所以标准曲线的下限，大概设在高於2到3倍的QL。QL的要求就是在连续进样六次的%RSD要小於1%。有了这下限浓度，我们就可以决定上限的浓度。这时可以看我们分析制剂样品的含量。把制剂的含量，经过稀释后的浓度（1:100或1:1000)定为我们的靶点浓度。而这一点最好在标准曲线的中点。美国FDA规定的标准曲线范围只是靶点浓度的上下限百分之五十。如果靶点浓度是10mg/mL，那上下限就是5到15mg/mL。所以看看通常我们做的标准曲线是往往超过这个范围的。有了对照品的上下限浓度，我们就可以配制两个接近浓度的对照品。一个做为工作对照品(workingstandard)，另外一个做为检验对照品(checkstandard,monitoringstandard,standardcheck)。把工作对照品做一系列的稀释，最好有6个不同浓度。每样我们进六针，一共就是36组数据。有了浓度，有了相对的峰面积，我们就可以做线性分析(linearregressionanalysis)了。有的人把(0,0)算入标准曲线的一点那是不对的。因为即使您打空白样品，没有峯，面积绝不是0。因为，我们使用紫外检测器，是有基线信号的。而我们的检测器无法测出基线的面积啊。测不出来并不表示没有（当然，有人说我们用的检测器可以设置参考波长啊，以后我们可以再讨论）。您看，当我们用一般光谱仪器的时候，我们是可以把空白放在另外一个槽中测吸收(absorbance)。但是色谱的检测器没有多一个槽，也就无法测量流动相的吸收了呀。您看，RI检测器就可以把流动相打入槽中做为背景信号啊。建立了标准曲线，就有两种可能性。一种情形就是曲线经过原点或者非常接近原点。经过原点的这种情况很少。如果您使用長波长，或者使用的有机流动相吸收小。因为基线的吸收小，所以曲线是可以经过原点的。因为，我们看到任何样品的信号其实都包含了基线的信号。如果是这种情形，您可以使用标准曲线上的任何一点来做单一曲线的靶点来定量。而样品的浓度，可以配制到锁定标准曲线浓度内。这时后我们说我们分析的偏差(analyticalbias)接近於0。另外一种情形，是我们经常看到的就是标准曲线不经过原点。不经过原点就是说有一定的分析偏差。如果我们要避免偏差，我们就必须要使用标准曲线来定量。也许我们不需要每次用6个浓度，可以缩小为三个点，但是必须横跨下限，中限及上限（必须与6个点的曲线比较而且认证）。这样还是麻烦啊，所以我们想办法只要用一个靶点浓度来定量，而且（与标准曲线比较）偏差不会太大。要达到这一个目标，当然是选择高浓度的对照品。因为，选择高浓度的对照品，基线的信号相对的影响就小。可是，在定量上，我们是希望进量样越小越好，这样不影响我们的准确度，也不至于看到我们不想看到的杂质或相关物质。通常我们就选择中间点，做为我们的靶点浓度了。我们把标准曲线做好了，把曲线的方程式求出来，就可以得到一些统计的数据。这个时候我们可以把每个浓度的峰面积带入方程式，求出浓度的实验值。这是实验值与原来配制的浓度比就是我们的回收率。这个回收率是根据标准曲线求出的。回收率当然是应该接近100%的。也就是我们的分析偏差接近於0。另外一方面，我们可以分别使用每一个对照品的浓度，求出该浓度的响应值(responsefactor)，有了这个响应值，我们可以根据其他浓度的峰面积，求出每个浓度的实验值。有了这个实验值，我们可以与原来的配制浓度求出回收率。您就会发现，以高浓度为对照品来定量低的浓度回收率越小。反之亦然。如果以一个浓度来定量同样浓度，分析的偏差就不存在了。这也就是我们可以选择单一靶点浓度来定量的根据。但是要记住的就是样品的浓度一定要配制到对照品单一靶点的浓度。否则，偏差自然就大了。一般我们做色谱，除了杂质或相关物质。为了能够检测到0.1%的含量，我们通常是需要注射大量的样品。注入大量的样品，自然有许多问题。尤其在定量主成份上。所以，我是主张用两个单独的方法。一个是用来定量主成份，进样量小，时间短的等度色谱法。另外一个就是梯度，长时间，进样量大的方法来定杂质及有关物质。