树舌灵芝多糖的分离纯化及抗氧化活性研究

1安徽大学江淮学院本科毕业论文题目：树舌灵芝多糖的分离纯化及抗氧化活性研究学生姓名：张珊学号：01124022系别：理工部专业：生物科学入学时间：2012年09月导师姓名：吴庆喜职称/学位：讲师/博士导师所在单位：安徽大学生命科学院完成时间：2016年04月2树舌灵芝多糖的分离纯化及抗氧化研究摘要目的：研究树舌灵芝多糖的分离纯化及抗氧化作用。方法：利用传统的水提醇沉的方法得到粗多糖，采用超滤的方法进行分离纯化，得到单一组分多糖,并从分子量大小,红外光谱,单糖组成等进行简单的表征分析,进一步研究了单一组份多糖对羟自由基，DPPH自由基清除能力。结果：分离纯化得到单一组分的糖GT-2分子量为5.04×103，红外光谱分析表明树舌灵芝多糖GT-2具有典型的多糖吸收峰是β-葡萄吡喃糖，单糖组成得到五种单糖的摩尔比为1：3.3:6.2：14.35：17。结论：用超滤得到的单一组分的多糖GT-2分子量较小，蛋白质含量较少，具有典型的多糖吸收峰，由甘露糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖组成，抗氧化研究表明具有很强的抗氧化能力。关键词：树舌灵芝多糖；超滤；抗氧化作用；表征分析3PurificationandAntioxidantActivityofGanodermalucidumPolysaccharidesIsolatedTreeTongueSummaryObjective:Tostudythewater-solublepolysaccharidePurificationandantioxidanteffects.Methods:Thetraditionalwaterextractionandalcoholprecipitationmethodobtainedcrudepolysaccharide,wereisolatedandpurifiedbyultrafiltrationmethod,singlecomponentpolysaccharide,andcarriesonthesimplecharacterizationanalysisfromthesizeofthemolecularweight,infraredspectroscopy,monosaccharidecomposition,thefurtherstudyofthesinglecomponentpolysaccharideonhydroxylradical,DPPHfreeradicalscavengingability.Result:SeparationandpurificationofgetsinglegroupofsugarGT-2molecularweightis5.04x103andinfraredspectrumanalysisshowedthatGanodermaapplanatumpolysaccharideGT-2istypicalofthepolysaccharideabsorptionpeakisbeta-Grapepyranoseandmonosaccharidecompositionswerethemolarratiooffivekindsofmonosaccharide1:3.3:6.2:14.35:17.Conclusion:ObtainedbyultrafiltrationsinglegroupofpolysaccharideGT-2molecularweightsmaller,lessproteincontent,withthetypicalabsorptionpeakofthepolysaccharide,composedofmannose,glucuronicacid,glucose,galactose,arabinose,antioxidantresearchshowhasverystrongantioxidantability.Keywords:Ganodermalucidum;Ultrafiltration;Antioxidant;CharacterizationandAnalysis4目录1引言...........................................................11.1树舌灵芝的研究..............................................11.2树舌灵芝多糖功能活性研究....................................11.3树舌灵芝多糖的分离纯化研究进展..............................11.4本课题研究的意义及目的......................................22材料、试剂和仪器...............................................32.1材料........................................................32.2试剂........................................................32.3仪器设备....................................................33方法...........................................................33.1原材料的处理................................................33.2树舌灵芝多糖的提取..........................................33.3树舌灵芝多糖的分离纯化......................................33.4树舌灵芝多糖单一组分的简要表征分析..........................33.4.1树舌灵芝多糖紫外扫描......................................33.4.2单一组分灵芝多糖总糖含量测定..............................43.4.3分子量测定HPLC法........................................43.4.4单糖组成.................................................43.4.5红外光谱.................................................43.5树舌灵芝多糖单一组分的抗氧化研究............................43.5.1对DPPH清除作用..........................................43.5.2对羟基自由基清除作用.....................................53.6数据处理....................................................54结果与分析.....................................................54.1树舌灵芝多糖含量的测定......................................554.1.1葡萄糖标准曲线...........................................54.2树舌灵芝多糖紫外扫描分析....................................64.3分子量测定分析..............................................64.4单糖组成分析................................................84.5红外光谱分析................................................94.6抗氧化作用的研究............................................94.6.1对DPPH清除作用分析.....................................104.6.2对羟基自由基清除作用分析................................115结论与展望....................................................12主要参考文献.....................................................14致谢...........................................................1561引言1.1树舌灵芝的研究灵芝又称灵芝草、神芝、芝草、仙草、瑞草，是多孔菌科植物赤芝或紫芝的全株。根据我国第一部药物专著《神农本草经》记载：灵芝有紫、赤、青、黄、白、黑六种，性味甘平。灵芝原产于亚洲东部，中国古代认为灵芝具有长生不老、起死回生的功效，视为仙草。树舌灵芝为灵芝科（Ganodermataceae）灵芝属（GanodermaKarst)高等真菌，世界广布种。近年来，随着树舌灵芝化学成分及药理活性不断研究树舌灵芝已引起国内外学者的广泛关注。现代医学和药理研究证明，树舌灵芝的主要有效成分多糖，三萜类化合物和甾醇类化合物都具有重要的生理活性，树舌灵芝有效成分作为新药在临床应用上将占一定的位置[1]。树舌灵芝药用可见于《中国药用真菌图鉴》和《长白山植物药志》，其性平，微苦，能抗癌，止痛，清热，化积，止血，化痰，消炎解毒，临床多用于治疗乙型肝炎，食道癌，肺结核，神经衰弱等，在我国和日本民间作为抗癌药物应用已久[2]。1.2树舌灵芝多糖功能活性研究树舌灵芝多糖中含有多种化学成分，国内外工作者通过对树舌灵芝菌丝体和子实体的深入研究，迄今为止从中分离出了多糖，甾体化合物，三萜类化合物，脂类，有机酸等[1]，本课题主要以多糖研究为主。NakashimaS.等[3]研究认为树舌灵芝多糖制剂能增强小鼠对蛋白抗原的迟发过敏性反应的诱导作用，同时能扩大T细胞对IgQ抗体反应的记忆范围。（提高免疫力）于英君等[4]研究表明树舌灵芝多糖GF对脾细胞增殖作用有一定的量效关系，一定浓度下GF对产生IgM的抗体生成的细胞数有抑制作用，但较环磷酰胺弱。GF对脾脏的重量有增加作用说明GF有刺激脾脏细胞增殖作用，从一定意义上来说树舌灵芝多糖GF有改善免疫系统内环境的作用。高斌等[5]研究表明，树舌灵芝多糖（经鉴定总糖含量为97.8%，属于葡聚糖）在体外可协同ConA激活T淋巴细胞增殖效应协同ConA诱导Th细胞产生IL-α,-IFN。在体内可增强ConA诱导T淋巴细胞增殖效应。增强Th细胞产生-IFN的能力。说明树舌灵芝多糖在体内外均促进Th细胞的功能。（抗肿瘤）在本实验室前期的研究中发现粗多糖的抗氧化活性较高，且多糖组分较复杂，肯定存在一种有效活性组分多糖。对于寻找这种单一组分的多糖对于树舌灵芝多糖的研究意义巨大。1.3树舌灵芝多糖的分离纯化研究进展多糖为灵芝属真菌经提取所得到的有效成分之一，受到医学工作者的重视，研究报道也最多，灵芝多糖一般采用热水或稀碱提取，提取时间不宜过长，7以防止多糖水解[6]。SasakiT等[7]采用乙醇和十六烷基三甲基氢氧化铵分布沉淀法，从树舌灵芝水提取物中分离出一种多糖类物质G-Z。将完全酸水解后，能检测D-葡萄糖以及微量的木质糖，该糖经鉴定为葡萄糖。我国学者梁忠岩等[8]对树舌多糖结构也进行了深入研究。由CF1脱色得多糖CF1a，并测得其分子量为14万，研究表明，CF1a有多末端或多1→6连接，核心结构不被氧化的。Mizuno.T等[9]