核干细胞生长因子的研究进展

核干细胞因子的研究进展[摘要]干细胞和肿瘤细胞相似的自我更新机制意味着它们有一个共同的调节机制。核干细胞因子优先表达在胚胎干细胞和多数肿瘤细胞的细胞核中，它扮演着维持干细胞和肿瘤细胞自我更新和增殖的角色。因而对核干细胞因子的结构、功能和作用机制的研究，可以进一步阐明调控干细胞和肿瘤细胞自我更新的分子机制，也为肿瘤的诊断和治疗提供一个新的思路和方法。[关键词]核干细胞因子；干细胞；肿瘤细胞AdvancesintheResearchonnucleosteminSUNYonggang,FANGDianchunDepartmentofGastroenterology,SouthwestHospital,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China[Abstract]Theuniquepropertyofstemcellsandtumorcellstoself-renewsuggestsspecificmechanismsthatregulatetheircell-cycleprogression.Nucleostemin(NS)isexpressedpreferentiallyinthenucleoliofembryonicstemcellsandseveralcancercelllines.Itisessentialforstemandcancercellproliferationandimplicatedinoncogenesis.therefore,toelucidatethestructure,functionsandactionmechanismsofNSisnotonlycontributestotheunderstandingofthethemechanismsthatregulatestemcellsandtumorcellsproliferationbutalsohelpstodevelopnewtechniquesoftumordiagnosisandtreatment.thisarticlereviewstheadvancesintheresearchonnucleostemin[Keywords]nucleostemin;stemcells;tumorcells干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化增殖潜能的原始细胞,根据干细胞的来源及分化潜能,可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞[1]，肿瘤细胞无限增殖特性与干细胞相似，肿瘤可能通常起源于正常干细胞的转化，相似的信号通路可能既调节干细胞也调节癌细胞的自我更新，且肿瘤细胞中可能包含有“肿瘤干细胞”[2]（cancerstemcells）----它们是一些极少的具有自我更新不定潜能的驱使肿瘤形成的细胞正是这群特异性细胞促使肿瘤的产生和发展。2002年，Tsai和Mckay[3]在研究一些被干细胞优先表达并与细胞增殖调控有关的基因和蛋白时，报道发现了一个新的核内蛋白。并将它命名为核干细胞因子（nucleosteminNS），本文将就NS的生物学特性及其作用机制做一综述。1、核干细胞因子的发现及其生物学特性Tsai等[3]在实验中发现通过无性系的分析显示中枢神经系统干细胞能够从发育的鼠脑中分离出来，在分化以前，所有的干细胞分开并表达巢蛋白，即一种神经上皮前体的特征性中间丝，在培养基中撤掉碱性成纤维细胞生长因子，增加10%的胎牛血清，8天后这些细胞有效的分化为神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞。利用体外中枢神经系统干细胞快速分化的特点，通过使用未分化池作为检验器分化池作为驱动器建立一个消减信息库，从这个信息库里，在皮质层干细胞中鉴定出含量丰富的两个克隆(SR204和SR75)，一个已知的基因(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶在胆固醇合成中是个限速酶，在调节果蝇属的原生殖细胞迁移中起着胆固醇依赖性的作用。目前的研究集中在克隆SR204上，发现它在干细胞中丰富的表达，在干细胞分化后表达量迅速下调。SR204命名为NS是因为它的核仁定位与优先表达在皮质层干细胞。兔的NScDNA包含1810核苷酸，鼠的NScDNA包含1813个核苷酸，序列分析显示全长的mRNAs由1617核苷酸的开放阅读框架，5'非翻译区(UTR)的一个框内终止密码子一个最佳的Kozak序列，3'UTR的多腺苷酸化信号，开放阅读框架编码一个538个氨基酸，分子量为61kD的蛋白，兔与鼠的NS有90%同源性和94%相似性，PROSITE分析和保守区的搜寻鉴定出两个限定GTP结合蛋白的共有基序，N末端的碱基区和C端的酸性结构域。PSORT分析显示多重核定位系列和卷曲螺旋区，在基因数据库中blast分析显示人类的同系物与兔的序列有81%的同源性，人类的基因是从雌激素诱导的增强表达的乳腺癌细胞系中分离出来的。人的NS基因定位于3p21.1，与小鼠有81%的编码同源，NS蛋白有538个氨基酸，分子量为61KD，由一个碱性区域（B），一个双螺旋区（CC）、GTP结合构件（G4、G1）一个酸性区域（A）组成。2、核干细胞因子的作用机制2.1NS功能的分子机制为了说明NS功能的分子机制，Tsai等[3]进行了一系列的突变分析，构建了缺失碱性区域（dB；密码子2-46）、卷曲螺旋区域(dCC;密码子61-87),G4GTP结合基序、(dG4;密码子177-180)、G1GTP结合基序(dG1;密码子256-263)、酸性结构域(DA；密码子460-503)、碱性和G1区域双缺失区域的情况，当转染至U20S细胞，所有的突变体位于细胞核，但是在细胞核的分布表现出不同的分布模式，没有N末端碱性区域（dB），突变蛋白（dB）则在核浆分布更加弥散。另一方面，缺乏G4或G1-GTP结合基序的突变体与核仁区域结合形成不规则聚集物并扭曲核仁结构。为了测试这些突变体形成聚集物的能力是否依赖它们的核仁定位，制成缺失碱基和G1区域的双突变(dB/G1)，虽然这个突变蛋白仍然形成聚集物，但从核仁区域离解而dCC或DA却不能产生与细胞内NS分布或核仁形态相一致的改变，说明N末端碱性区域决定了核仁的定位，GTP结合基序则调节NS蛋白聚集状态2.2NS与p53p53是个一个与应激反应有关的关键细胞周期检查点蛋白和肿瘤抑制基因，功能丧失或基因突变将导致异常的细胞周期恶性循环，细胞生长失控，促使恶性肿瘤形成。p53的功能被几种核仁蛋白调节，包括ARF、Werner综合征蛋白。ARF是一个通过MDM2来稳定p53的肿瘤抑制因子，它和NS一样，也位于核仁，p53在干细胞群中表达而且在整个分化过程中保持不变，另一方面，ARF的表达水平在中枢神经系统干细胞中是低水平表达，当干细胞分化时候表达水平上调，表达模式与NS相反。ARF敲除的小鼠表现出对衰老的抵抗力增强，带有WRN基因突变的病人显示出基因不稳和过早老化。小鼠NS基因敲除实验和免疫共沉淀发现NS和p53存在于一个蛋白复合体，NS可能与p53相互作用并阻碍它的生长抑制能力。由于在核仁中未发现p53，NS与p53的相互作用可能发生在核质中[3]。Ma[4]等认为NS受ARF的调节，并且NS以p53依赖途径调控着细胞G1/S的转换。2.3NS的干扰和过表达NS蛋白敲除实验揭示NS的功能能够保持干细胞和肿瘤细胞的增殖能力，通过RNAi敲除，8%的U20S细胞残留在细胞周期中，甚至免疫染色不能检测到NS，增殖能力的保持可能是通过剩余的NS所驱动。蔡子微[5]等用NS特异性siRNA表达载体转染Hela细胞，观察转染的Hela细胞体内外增殖的变化，发现体外培养的NS-siRNA-Hela细胞中NS表达显著降低,S期细胞的百分率明显低于正常Hela细胞组，G0/G1期细胞百分率显著升高，而处于S期细胞的百分率降低和G0/G1期百分率的升高则是细胞增殖减慢的一个指标[6]。张志宏[7]等运用RNA干扰抑制膀胱肿瘤细胞BIU287核干细胞因子基因表达，发现NS的表达丰度明显下调,且其体外增殖速率明显降低。NS的过表达也会降低干细胞和U20S细胞的增殖速率，缺失分析为过表达类型提供了一个解释，为NS的调节机制提供了一个新的观点，缺失分析显示缺少N末端碱基的突变体弥散分布在核浆里，缺少GTP结合位点的突变体聚集在核仁形成聚集物并使核仁结构断裂，缺失碱基和G1GTP结合基序的突变体则分布在核仁外，这些结果提示N末端碱基区域决定了核仁的定位，GTP结合基序调节着蛋白聚集物的结构。NS的过表达导致分裂前期的细胞数量减少但不影响S期细胞数量，死亡细胞数量的增加依赖与N末端碱基区域，在GTP结合位点缺失的突变体中。NS过表达对有丝分裂期中的细胞数量和细胞存活能力的影响效应得到了显著性的增强，虽然S期的细胞数量保持不变，与野生型蛋白相比，在表达GTP缺失的突变体中，BrdU标记的模式则完全不同，BrdU标记的模式发生在突变蛋白的聚集物中，表明NS的过表达可能直接分裂了核仁复合体或间接引起细胞周期停留在S期末，导致细胞的死亡[3]。2.4NS与TRF1蛋白我们知道，TRF1蛋白是端粒长度的负调节因子[8]，能够以二聚体的形式通过其C端的myb结构域与端粒DNA结合,强化端粒的有序结构,使其处于一种“关闭”状态,导致端粒酶无法接近端粒末端发挥作用,缩短端粒长度,而端锚聚合酶(Tankyrase)对它进行聚ADP2核糖基化修饰,可使其从端粒DNA上脱落，解除它对端粒长度的调节作用[9]，而且从端粒上解离下来的TRF1分子可被蛋白酶体系通过泛素化修饰所降解[10]。Qubo等[11]证明NS能够和TRF1蛋白相互作用，提高其降解率，但并不是通过泛素化修饰的途径来降解TRF1蛋白2.5NS在干细胞中的表达Wael[12]等研究发现NSmRNA在骨髓干细胞中有很高的表达量，随着细胞在培养基中的扩增，其量仍然保持不变，当干细胞被成纤维细胞生长因子刺激增生时，NS的表达的增加呈剂量依赖性，RNA干扰实验消除了FGF-2的增殖效应，当骨髓干细胞分化成为软骨细胞，脂肪细胞，骨细胞时候，NS的表达量是70%–90%低于在单层(细胞)培养中的未分化细胞。因此推断NS是成人骨髓干细胞未分化的标志，它调节着这些细胞的增殖。Baddoo[13]等也发现NS在鼠的间充质干细胞中也表达。有作者认为NS的阳性并不能认为是皮肤干细胞的表面标志[14]。骨髓间充质干细胞是多能干细胞它有自我更新的能力和分化为多种细胞的潜力，Yaghoobi[15]等运用RT-PCR和免疫细胞化学法检测神经分化诱导前后的鼠骨髓间充质干细胞中NS表达，发现与Oct-4,Nanog,NeuroD等增殖与分化的关键调节因子相比，在未分化或已分化好的骨髓间充质干细胞中未检测NS的表达，相反NS在未分化的骨髓间充质干细胞中有高表达，在诱导分化后表达量迅速下降在分化后的6小时，表达完全消失，NS的表达量的消失与神经微丝M、神经微丝H，肌腺苷磷酸、突触素、神经元特异性烯醇酶等的出现是一致的。NeuroD和CyclinD1的表达在分化过程中也会下降，但下降速率要小于NS，因此认为NS而不是Oct-4或Nanog调节着骨髓间充质干细胞的自我更新与增殖。在水螈的再生中，分化好的细胞能够恢复为干细胞样细胞，仍保留着增殖能力与分化潜能。Maki[16]等克隆了水螈NS的同系物，并分析了它的调节机制，发现在晶状体的再生过程中，NS的表达被启动，在进入下一个细胞周期前，迅速累积于去分化的色素上皮细胞中，在肢体的再生过程中，在芽基形成前也迅速累积退化了多核肌纤维的核仁中，由此认为NS在水螈细胞的去分化中起着重要的作用。2.6NS在肿瘤细胞中的表达Si-JinLiu等[17]检测了NS在胃腺癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、食管鳞癌、正常肾组织和肌肉组织等的表达，通过RT-PCR,Northern印迹和Slot印迹分析发现这些良恶性组织以及良性的增生组织都有NS的高表达，同时在人类胎盘组织也发现了NS的高表达，这可能是