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核酸生物化学主讲人：黄熙泰实验室：新生物楼214第一章核酸（NucleicAcids）和核苷酸（nucleotides）一.核酸和核苷酸1.核酸的发现1868FrederickMiescher(1844-1895)一种质粒（plasmid)的电子显微镜图2.核酸的组成核酸（DNA或RNA）核酸酶水解核苷酸酸水解或酶解碱基核糖磷酸3.碱基（base）4.核苷（nucleosides）核糖，脱氧核糖与碱基的缩合产物为核苷。5.核苷酸（nucleotides）6.稀有碱基（修饰性碱基）二.磷酸二酯键与核酸链（多核苷酸）1.核苷酸通过磷酸二酯键连接成“寡核苷酸”,“多核苷酸”。少于50个核苷酸残基的核苷酸聚合物称为寡核苷酸，多于50个核苷酸残基称为多核苷酸。天然核酸为多核苷酸（polynucleotide）。2.核酸链的简化表示法如无特别注明一条核酸链左边为5‘末端，右边为3’末端。三.核苷酸残基中各基团的性质影响核酸的特性a.磷酸基团的pK＝1，使核酸呈酸性（在细胞中以“盐”的形式存在）；b.呋喃核糖（或脱氧核糖）的构象影响核酸链的空间结构；RNA的2‘－羟基使RNA比DNA具有更活泼的化学性质；c.碱基碱基分子环上的多个π键组成共轭双键系统，使碱基具有平面结构和“芳香性”；碱基在核酸链内形成碱基堆积（范德华力，偶极作用力和疏水力等）参与维系核酸高级结构；碱基之间能形成多个氢键（形成碱基配对）是核酸生物活性和结构维系的关键；碱基对紫外光的吸收是核酸检测和研究的重要依据（见图）；碱基的同分异构现象是引起基因突变的重要原因，内酰胺结构（lactam）是pH＝7时碱基的主要存在形式；以尿嘧啶为例pH＝7时，lactam：lactim＝104-105：1碱基的互变异构是造成复制误差的主要原因之一（见图）；碱基对紫外光的吸收造成核酸对紫外光的吸收。O.D.（A）230260280λ（nm）A＝O.D.=kCl(l=1cm),当C为克分子浓度时，规定吸收系数k为ε，即A＝εC对核酸而言，用ε（p）表示某核酸溶液在260nm平均克分子核苷酸残基的吸收系数Molarabsorptioncoefficient(1/M.cm)一般地说RNAε（p）的约8000－10000；DNAε（p）的约6000－8000；举例：假定一核糖核苷酸残基的平均分子量为320，测得某一核酸样品的O.D.（260nm）＝1，则此RNA样品的溶液的浓度：C＝A/ε（p）＝1/8000＝0.000125MC＝0.000125×320＝0.04g/L＝0.04mg/ml＝40μg/ml核酸的制备技术关键：用去污剂脱蛋白，使DNA免受核酸酶降解。定量测定核酸的三种方法：a.“定磷”；b.“定糖”；c.紫外吸收法四.核酸结构1.核酸结构可分成三级核酸的一级结构：核酸的共价连系结构，即核酸链上的核苷酸顺序（sequence）人类基因组计划（HumanGenomeProject）核酸的二级结构：由核酸分子内次级键所形成的任何有规律的稳定结构。核酸的三级结构：DNA的拓扑结构。染色体的不同层次的折叠。2.导致DNA双螺旋结构建立的一些基础a.证明DNA储存遗传信息；转化因子的发现；噬菌体T2感染大肠杆菌的同位素示踪实验（见图）；b.DNA碱基组成的Chargaff规则；c.DNA纤维的X光衍射分析（见图）；3.DNA双螺旋结构的Watson-Crick模型（见图）（1）双链右手螺旋围绕一共同的轴（螺旋轴）缠绕；（2）亲水的糖－磷酸连接成的主链（backbone）位于螺旋的外侧，而面对水的环境介质，疏水的碱基堆积于双螺旋的内部，碱基平面近乎垂直于螺旋轴；（3）两链之间的碱基形成A＝T，GC配对，即形成碱基对，这种配对正好填满两链之间的距离。A＝T有两个氢键，GC对有三个氢键。两条链互补，一条链的碱基顺序决定了另一条链的碱基顺序；（4）两条链反平行，具有相反的极性；（5）每个螺旋3.4nm，每个碱基对之间的垂直距离0.34nm，10个碱基对一螺旋，螺旋直径2.0nm；（6）由于双链之间的空间关系，使两链之间产生一条大沟(majorgroove)和一条小沟（minorgroove）;（7）维系DNA双螺旋结构的力量是氢键和碱基堆积，DNA通过碱基配对实现双链互补。4.DNA二级结构的动态性质a.双螺旋DNA的三种主要构象B型DNA，A型DNA，Z型DNA（左手螺旋DNA）；b.与特殊碱基顺序相关的不寻常DNA结构（1）颠倒重复（invertedrepeat）与十字架结构（cruciformstructure），即回文结构（parlindrome）；“落鹤岛上岛鹤落垂柳岸边岸柳垂”5’-TTAGCACGTGCTAA-3’·3’-AATCGTGCACGATT-5’（2）镜像重复（mirrorrepeat）与三螺旋结构；5’-TTAGCCCCGATT-3’（3）同向重复，串连重复（directedrepeat，tamdemrepeat），大量存在于真核细胞DNA中；5’·····GGACTTACGGACTTAC·····3’3’·····CCTGAATGCCTGAATG·····5’5.RNA的种类和结构a.RNA的种类和功能简述（1）信使RNA（messengerRNA，mRNA)（2）核糖体RNA（ribosomeRNA，rRNA)（3）转移RNA（tRNA，transferRNA）（4）其他RNA，如snRNA（smallnuclearRNA）等b.RNA的结构单链RNA在水溶液中取右手螺旋结构，由碱基堆积造成；嘌呤碱基之间的堆积力大于嘌呤与嘧啶之间的堆积力大于嘧啶碱基之间的堆积力；RNA的分子内互补顺序造成许多分子内双螺旋和发卡结构（hairpin），RNA的双螺旋结构都是A型结构，RNA双螺旋中常出现G=U配对（一种特殊的碱基配对）。五.核酸的化学1.核酸的变性和杂交在极端的pH值或较高的温度下，DNA或RNA的氢键会被打断，导致解螺旋，双链分离，这个过程称变性。（极低的离子强度或变性剂也可导致变性）2.DNA的热变性DNA水溶液的热变性伴随着DNA样品在260nm紫外吸收的增加和粘度的下降。DNA的熔解温度（Tm，meltingtemperature）定义：DNA在水溶液中的热变性发生在一个狭小的温度区间，当DNA受热变性时紫外吸收增加值到达总增加值的一半时的温度称此DNA的熔解温度；影响DNATm值的因素：溶液的pH值，离子强度和DNA的GC百分含量。3.核酸的复性和杂交复性：热变性的DNA溶液缓慢冷却（退火，annealing）使DNA互补双链重新形成双螺旋的过程，称复性（renature，reassociation）。双链DNA变性后的复性过程的第一步是个双分子历程，复性速度与核酸浓度的关系可以表示为：－dC/dt=kC2……(1)-dC/dt为复性速度微分，负号表示单链DNA浓度的减少；k为复性动力学常数；C是以Molar核苷酸表示的单链DNA浓度，把(1)式在to-t之间积分，得C/C0=1/(1+kC0t)……(2)当反应完成一半时,即在时间t1/2时,C/C0=1/2=1/(1+kC0t1/2)C0t½=1/k=K……(3)K的单位是升/克分子核苷酸·秒，(3)式表明某DNA分子在复性过程中其初始浓度C0与复性完成一半时间的乘积是个常数。K值因复性DNA分子分子量的增大而增加。C0t½或K又称为DNA分子的复杂度（complexity，C），是各物种基因组大小（DNA含量）的衡量。使热变性DNA(或RNA）溶液骤然冷却的过程称为“淬火”（quench），淬火防止互补链重新形成双螺旋，保持单链状态。4.分子杂交（hybridization）不同来源的单链DNA(或RNA)互补顺序之间形成双螺旋的过程称为“杂交”。用于检出目的基因的标记DNA或RNA片段称作探针，它们可以和目的基因杂交。杂交反应是分子生物学常用的检验方法。5.核酸和核苷酸的化学改变在没有酶参与的情况下，DNA的化学改变确实发生，但很缓慢，DNA的化学改变会造成严重的生理后果。a.核苷酸的脱氨反应脱氨化合物NaNO2，R1－N－N＝O，NaNO3等。R2b.紫外光和电离辐射紫外光可使DNA中的相邻嘧啶碱基发生二聚化；形成环丁烷型嘧啶二聚物；c.脱嘌呤酸可以使核酸脱嘌呤（apurinicacid）；d.烷基化试剂；6.DNA的酶法甲基化a.DNA甲基化影响基因表达；b.甲基化保护DNA不受限制酶切割；c.甲基化促使DNA的GCGC……序列采取Z型结构；六.核酸酶1.定义：能切断核酸磷酸二酯键的核酸水解酶称核酸酶（Nucleases）。2.核酸酶的分类a.以对糖特异性分类核糖核酸酶（RNases）脱氧核糖核酸酶（DNases）非特异性核酸酶（如蛇毒磷酸二酯酶）b.以切割方式分类外切核酸酶（exonuclease）：从核酸链的一端逐个水解磷酸二酯键产生单核苷酸，外切酶一般有末端特异性；外切核酸酶5‘-AAGCTGTT-3’外切核酸酶内切核酸酶（endonucleaese）：从核酸链的内部切割磷酸二酯键的酶，内切酶常有碱基顺序特异性；内切酶5‘-ACTACGAATTCGAGC-3’3’-TGATGCTTAAGCTCG-5’内切酶外切酶一般有末端特异性；内切酶常有碱基顺序特异性；3.DNA限制性内切酶能识别一定核苷酸顺序，并在识别顺序或识别顺序附近同时切割DNA双链的酶，称为DNA限制性内切酶。限制性DNA内切酶与DNA甲基化酶构成“限制－修饰”系统，是用于保护细菌本身的染色体DNA，限制外来入侵DNA的一种防御系统。限制型内切酶的命名：以分离出限制酶的菌株属名的第一个字母（大写），加上细菌种名的前两个字母来表示。有时再加菌株名和发现次序，如大肠杆菌细胞R株第一个发现的限制酶称EcoRI。DNA限制酶的分类酶的类型IIIIII蛋白结构内切酶活性双亚基双三亚基双与甲基化酶功能酶功能酶活性分离识别顺序4－8个碱基5－7bp由两部分的短序列，不对称构成具回文结构不对称切割位点和识别位点在下游1000bp相同24-26bp处随机ATP需要NOYESYES限制性片断长度多态性（RFLP，RestrictionFragmentLengthPolymorphism）可以看成是物种基因组在限制酶切点上的遗传多态性，例如在某一限制酶识别的靶位点碱基改变，导致由相关限制酶切割产生的片断长度和数目上的差异，RFLP用于对基因组进行遗传作图，是一种常用的遗传标记。限制片断长度与限制酶识别位点序列长度的关系。可能产生的限制片段长度4碱基位点44＝256bp6碱基位点46＝4098bp8碱基位点48＝65568bp琼脂糖凝胶电泳－－检测DNA酶解产物快速而又准确的方法。4.遗传图和限制图遗传图是各遗传位点沿着染色体排列的相对顺序和位置图，其距离用图单位表示。限制图是各限制酶在某一DNA分子上切点的线性排列，点间距离以碱基对（bp，Kb，Mb）表示。七.DNA碱基顺序的测定(DNAsequence）Maxam-Gilbert化学降解法；Sanger双脱氧末端终止法（酶法）；技术要点：（1）每次选择性地在DNA的某一种碱基处从切断核酸链，形成许多以这种核苷酸残基为末端的DNA片断；（2）把四组分别在不同碱基处打断的DNA片断进行电泳分离；（3）从电泳图上直接读出DNA顺序。Sanger的双脱氧末端终止法DNA测序需要：DNA聚合酶DNA模板Mg++dATP，dGTP，dCTP，dTTP引物(放射性标记，或不同荧光标记）把由DNA聚合酶催化的DNA聚合反应分成四组，每组额外再加入少量的一种双脱氧核苷三磷酸，例如第一组加入ddATP，反应产生以A为末端的各种互补于模板的核酸片断如下：模板3‘-GCAGCCAGCTAGTCTATC-5CGTCGGTCGACGTCGGTCGATGACGTCGGTCGATGAGACGTCGGTCGATGAGATACGTCGGTCGATGAGA