搜索
溶氧对氨基酸发酵的影响[摘要]溶氧(DissolvedOxygen,DO)是氨基酸发酵过程中重要的限制因素之一。溶氧浓度会严重影响菌体的代谢去路。较高浓度的氧能为菌体提供足够的能量，有利于前期菌体的大量繁殖，从而为后期生产积累做好准备。然而过高的溶氧易产生羟自由基，超氧根负离子等活性氧，抑制菌体的生长，甚至使菌体自溶；同时，高溶氧浓度易导致代谢分流，产生副产物甚至有害杂质，不利于后期的产物的积累和分离。低的溶氧会抑制菌体生长，当溶氧过低（低于临界溶氧浓度）时，菌体也会发生自溶现象。同时，低的菌体浓度不利与后期的发酵产酸。不同阶段菌体的耗氧量也不经相同，所以研究溶氧的控制对发酵的影响具有重要意义。本文主要以苏氨酸和异亮氨酸发酵中的溶氧控制研究为例，介绍一些溶氧控制的方法及其对生产的影响。关键词：氨基酸发酵溶氧控制苏氨酸异亮氨酸拟稳态分阶段控制模式代谢流1.苏氨酸发酵的溶氧控制1.1溶氧浓度的影响徐庆阳等通过对L-苏氨酸生产菌TRFC发酵产苏氨酸的研究发现，只有提供高于临界氧浓度（20%）以上的溶氧菌体生长和产酸才能取得较好的效果。充足的供氧使菌体呼吸旺盛，能保持较快的生长速率。但氧浓度过高时，又会产生活性氧破坏细胞组分，影响细胞代谢，并易产生杂质。然而当溶氧过低时，菌体的生长受限，镜检发现有少量细胞碎片，说明长时间的低氧水平（5%）导致部分菌体自溶。通过实验摸索出分阶段的控制模式:在延滞期维持20%溶氧，在对数期后维持50%溶氧，稳定期恢复至20%溶氧更有利于菌体的生长及产物的合成。用上述方法控制溶氧，在10L罐补料分批发酵36h,产酸可达118.9g/L，糖转化率为47.6%。1.2溶氧振荡控制研究然而微生物培养过程中普遍存在明显的振荡等非线性现象。实际上，由于细胞代谢状态不断受到内外环境因素的影响，细胞的代谢水平和代谢物的组成始终处在动态变化中，因此需要合理的反馈调控机制才能实现发酵过程中的代谢平衡，以持续地提高发酵产率。徐庆阳等又以L-苏氨酸的溶氧强制振荡发酵为对象，考察了在溶氧强制振荡发酵条件下各种产物和副产物的生物合成规律，为菌种的改良和发酵控制以及发酵器设计提供参考。他们设计了新的振荡发酵方式。溶氧振荡模式如下：在发酵前期Ⅰ(0~7h)，溶氧浓度以每小时下降10%的速度下降至25%，进行阶梯式振荡；发酵中前期Ⅱ(7~12.5h)，溶氧浓度在20%；发酵中期Ⅲ(12.5~23h)溶氧浓度在50%；发酵后期Ⅳ(23~36h)溶氧控制在20%进行周期振荡，振幅为5%，振荡周期为1h(图2a)。流加葡萄糖模式为：发酵12h后通过脉冲流加的方式继续流加葡萄糖(图2b)，使残糖浓度控制在15g/L左右。大肠杆菌经过种子培养进入发酵后以溶氧强制振荡模式进行培养，细胞生长进入对数期相对非振荡培养模式较慢，培养12小时检出乙酸，此后缓慢增长，最大值为0.8g/L;而对照组产乙酸较先,且增速较快，很快达到最大值1.8g/L，此值已介于抑制浓度1.5-2.0g/L,对菌体有较强的抑制作用。但前者则不会。另外，溶氧强制振荡培养的最大生物量达29.5g/L也较对照组的22.5g/L为高。（如左图）这些都为发酵产酸打下了良好条件。其原因可能是强制振荡模式下细胞可以充分利用基质中的葡萄糖，有利于协调葡萄糖的摄入能力强于TCA循环周转能力滴的矛盾，防止代谢一流带来的乙酸过量合成，从而有利于生物量的增加和产物的合成积累。另外，培养液中乙酸的过量积累将直接导致丙氨酸、分支链氨酸和芳香族氨基酸等福常务的合成，从而是目的产物L-苏氨酸的生物合成收到影响。发酵中的主要副产氨基酸是丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）和亮氨酸（Leu）。其质量浓度在不同控制模式下的变化如下图：从图4可以看出，副产物丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸的合成在非强制振荡模式下较强制振荡模式下的高出许多。而36h目的产物苏氨酸的质量浓度为39.5g/L，仅是强制振荡118.9g/L的1/3。也充分证明了溶氧强制振荡培养模式的优势。1.3溶氧强制振荡模式对代谢流分布的影响测定发酵后期的一个振荡周期(30h至31h)和非强制振荡在此阶段发酵液的缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、葡萄糖、丙氨酸及乙酸的胞外浓度，计算各自的积累或消耗速率如表1所示。用基于拟稳态假设基础上的分析方法做进一步分析发现：溶氧强制振荡(图5b)与非强制振荡模式(图5a)比较，在Glc6P节点处通往HMP途径的代谢流量由6.5提高至95.88，而流向6-磷酸果糖代谢流量从93.5降至4.1；在PEP节点处，通过提供苏氨酸前体物草酰乙酸的CO应代谢流量由45.1提高至86.1，相应的从PEP流向Pyr的流量从152.7降至81.9；从EMP途径和TCA循环的协调性方面考虑，TCA循环相对代谢流量1.86提高至17.78，更利于降低乙酸的产生。结合表1，在此过程苏氨酸对萄糖的质量转化率从30.0%增加至57.0%。这是因为强制溶氧振荡条件下，随着提供NADPH的主要途径HMP的代谢流量增大，其产生的还原力更有利于通过电子传递链将电子传递至O2，从而强化了从天冬氨酸至苏氨酸生物合成路径。同时，减弱由于TCA循环周转能力相对不足带来的乙酰辅酶A积累，进而降低乙酸以及丙酮酸积累而产生的丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸，进一步增加苏氨酸生物合成代谢流量。在溶氧强制振荡过程中，TCA循环相对代谢量的增加和绝对代谢流量的减少，一方面减少了乙酸的产生，促进菌体生长；另一方面将减少副产物方向的代谢流分配和因CO2释放而产生的碳架损失，从而使目的产物代谢流增加。小结：溶氧强制振荡工艺在目的产物产量提高的同时，减少了副产物的形成，有利于简化下游的产品回收和纯化过程，更适合大规模工业化生产。但控制过程稍显复杂，目前也只是停留在小罐培养的研究阶段，还有待进一步的研究与探索。2.异亮氨酸的溶氧控制2.1不同溶氧浓度条件对菌体生长的影响由于菌体在不同生理阶段对氧的需求不同，溶氧过高或过低都对正常发酵过程不利．溶氧过高会导致后期菌的活力降低，溶氧过低会影响前期菌体的生长．白亚磊等研究黄色短杆菌YILW发酵产L-异亮氨酸实验考察了5%、15%、25%、35%和45%溶氧条件下对L–异亮氨酸发酵过程中菌体量的影响，结果如左图所示．随着溶氧浓度的增大，比生长速率和生物量都在逐渐增大；当溶氧浓度达到25%后，溶氧浓度再增加，比生长速率和生物量增加的幅度都很小．这表明较高的溶氧浓度（25-45%）比较有利于细胞生长，可保持较快的生长速率，且在20h后3种情况下的菌体量基本达到稳定，高达21,g/L．当溶氧较低时，菌体的生长呼吸得不到满足，生长受限，致使菌体浓度过低，影响发酵中后期L–异亮氨酸的产酸速率．综合考虑确定25%溶氧作为菌体生长的最适溶氧浓度．2.2不同溶氧条件对产酸稳定期产酸速率的影响根据上述菌体生长曲线可知，在发酵前20,h基本上完成了菌体量的积累，20,h后进入产酸稳定期．以下考察了产酸稳定期，即发酵20,h后，分别以5%、15%、25%、35%、45%的溶氧浓度控制时的产酸速率，结果如下图所示．在5%溶氧条件下，虽然产酸速率比较稳定，但是产酸速率比较小，对L–异亮氨酸的积累不利；在35%和45%溶氧条件下，虽然在产酸稳定期开始时有较高的产酸速率，但是随着发酵时间的延长，产酸速率呈下降趋势，对酸的积累也有影响；而在15%和25%溶氧条件下，产酸稳定期开始时不但有较高的产酸速率，高达0.6,g/(L·h)，而且较高的产酸速率维持的时间也较长，有利于L–异亮氨酸的积累．2.3不同溶氧下L-异亮氨酸发酵的代谢流左表为菌体产酸稳定期主要代谢产物在不同溶氧浓度下的变化速率情况。同上用拟稳态法渴求的代谢流的系数分布进而判断溶氧对代谢流的影响。进入产酸稳定期，菌体基本不再增长，增大磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸的流量有利于更多的碳架流向目的产物．HMP途径作为提供NADPH的主要途径，增大HMP途径的代谢流是提高L–异亮氨酸生物合成所必需的．由左图可以看出：产酸稳定期内，在15%和25%溶氧条件下，由磷酸烯醇式丙酮酸通往草酰乙酸的流量分别为31.78,mmol/(L·h)和30.11,mmol/(L·h)，其中流向L–异亮氨酸分别为25.38,mmol/(L·h)和24.30,mmol/(L·h)；通往HMP途径的流量分别20.51,mmol/(L·h)和11.06,mmol/(L·h)；同时在15%溶氧条件下，乳酸、丙氨酸等副酸比在25%条件下的流量要小．比较两种情况下的代谢流分布，在15%溶氧下的代谢流分布比在25%溶氧下的更有利于L–异亮氨酸的积累．故在产酸稳定期，在15%溶氧控制条件下，更多的碳架导向了L–异亮氨酸的合成．这也说明了2.2图2中15%溶氧条件下比在25%溶氧下产酸速率高的原因．综上所述，发酵前期是菌体生长旺盛的时期，L–异亮氨酸合成量较少，提高溶氧浓度有利于菌体生长，25%溶氧较为适合生长期菌体生长需要．在产酸稳定期，菌体浓度基本不变，L–异亮氨酸大量合成，降低溶氧浓度，可增加前体物质天冬氨酸和NADPH的量，使得通往L–异亮氨酸的代谢流增加．运用代谢流分析可知：15%溶氧下更有利于产酸稳定期L–异亮氨酸的积累．此外，在15%溶氧条件下，目的产物L–异亮氨酸的累积量比在25%溶氧条件下的大；而乳酸、丙氨酸等副酸的累积量相对25%溶氧下有所减少，一定程度上提高了糖的转换率，也这有利于发酵产物的分离与提纯。小结：在L–异亮氨酸发酵过程中，在不同溶氧条件下，L–异亮氨酸的累积量有很大的不同，15%溶氧时高于25%溶氧的情况．因此根据代谢流分析结果确立了溶氧分段控制模式：菌体生长期，维持溶氧25%；产酸稳定期，维持溶氧15%．在该溶氧控制模式下，通过30L罐补料分批发酵60h，产酸可达31.8g/L，糖酸转化率可达18.3%，同时副酸的积累也大大下降．由此说明，在L–异亮氨酸发酵过程中，溶氧的控制对发酵过程有很大的影响，在不同的阶段控制不同的溶氧水平，不但对目的产物的累积量有很大影响，同时对副产物的积累也有很大的影响，副酸的减少不但可以减少发酵过程中的原料浪费，而且还对下游提取工作有利，可以降低提取难度和减少提取过程中的能耗．3.总结通过对氨基酸发酵过程中溶氧的控制能有效提高菌体和产物的量。由于菌种不同阶段的需氧量不同，分阶段控制溶氧浓度更有利于获得高的产物浓度并控制副产物的生成,一定程度上能降低能耗。上述苏氨酸和异亮氨酸的发酵溶氧控制都充分说明了这一点。为优化发酵控制提供了可行的途径.另外，强制溶氧控制方法是一种新的溶氧控制模式，实验结果证明该方法能够有效调节代谢流,使代谢向有利于生成产物的方向流动,在提高产物含量的同时有效降低了副产物的浓度,在菌体培养和获得高产方面具有其显著的优势。通过代谢流的分析能够更好的掌握溶氧对菌体代谢的影响，进而为菌种的改良，发酵控制及发酵器的设计提供参考。相信溶氧控制的研究能够对发酵带来新的收获！参考文献：1.XUQing-yang(徐庆阳),FENGZhi-bin(冯志彬),SUNYu-hua(孙玉华)etal.TheeffectofdissolvedoxygenonL-threoninefermentation(溶氧对L-苏氨酸发酵的影响)[J].Microbiology(中国生物工程杂志),2007,34(2):120-122.2.HUANGJin（黄金）,XIEXi-xian（谢希贤）,XUQing-yang（徐庆阳）etal.EffectsofDissolvedOxygenForcedOscillationontheBiosynthesisofL-ThreonineandShiftofMetabolicFluxinEscherichiaColiTRFC（溶氧强制振荡对L-苏氨酸发酵产率及其代谢流迁移的影响）[J]JournalofChemicalEngineeringofChineseUniversities（高校化学工程学报），2010,24（1）93-983.HUANGJin(黄金),XUQing-yang(徐庆阳),W