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溶菌酶的制备、蛋白质的测定及该酶比活力的测定Lysozymepreparation,proteindeterminationandthedeterminationofenzymespecificactivity生物制药工艺学期末考核讨论：报告人：（0834110）08届食品学院制药1班2011.4.29溶菌酶的来源：•1922年的一天，正在感冒的英国细菌学家AlexanderFleming发现，把一些鼻粘液加入细菌的培养基后会引起细胞的溶解。而这种存在于鼻粘液中的能杀死细菌的重要物质被认为是一种酶，Fleming命名其为溶菌酶（Lysozyme）。•那时，溶菌酶不能证明有临床价值。但是在酶机制的研究学习方面，溶菌酶扮演了一个很重要的角色。溶菌酶的结构在1965年,DavidPhillips和他在牛津的同事以0.2nm分辨率的X射线晶体（X-raycrystallography）结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构(tertiarystructure)。溶菌酶的作用机制：•溶菌酶是一种N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，该酶可以催化水解细菌细胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，使内容物溢出而是细菌溶解，阻碍致病细菌的活性繁殖，并杀死细菌。溶菌酶的制备•实验原理•实验材料、试剂及仪器•实验步骤•实验看法溶菌酶的制备•本实验主要是以鸡蛋清作为实验材料，采用D152型树脂柱层析法除去杂蛋白及等电点法提取溶菌酶的粗品溶菌酶的制备：•鸡蛋清中约含有0.3％的溶菌酶，分子量为14，000，等电点为11.1，最适溶菌温度为50℃，最适pH值为7。鸡蛋清溶菌酶化学性质非常稳定，当pH值在1.2～11.3范围内剧烈变化时，其结构仍稳定不变，遇热时该酶也很稳定，在pH4～7的范围内，100℃处理lmin，仍保持原酶活性。但在碱性环境中，该酶对热稳定性较差。其一级结构由129个氨基酸残基组成的一条多肽链，其稳定性主要与多级结构中的4对二硫键、氢键及疏水键相互作用。•人溶菌酶的溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。溶菌酶的制备•实验主要仪器、材料及试剂：（一）主要仪器：高速冷冻离心机、恒流泵、部分收集器（二）材料及仪器：D152大孔弱酸性阳离子交换树脂，新鲜鸡蛋，0.1mol/L磷酸盐缓冲剂，pH7.0,氯化钠，硫酸铵，0.5mol/LNaOH,0.5mol/LHCl,层析柱（2.6cm*30cm）,无水乙醇，聚乙二醇溶菌酶的制备•实验步骤：•蛋清样品的制备：取出蛋清，加入1.5倍体积的0.1mol/L磷酸盐缓冲剂，搅拌均匀，将pH值调至8左右，然后用八层纱布过滤，去滤液，量取体积并记录。溶菌酶的制备•实验步骤：•阳离子交换层析的制备：1、D152树脂的处理：将D152树脂先将蒸馏水洗去杂物，滤除，用1mol/LNaOH搅拌浸泡并搅拌4~8h，抽滤干NaOH,用蒸馏水洗近pH7.5左右，抽滤干，再用1mol/LHCl按上述方法处理树脂，知道全部转变为氢型，抽滤干HCl，用2mol/LNaOH处理树脂，是指转变为钠型，pH值不低于6.5。吸干溶液，加0.02mol/L的磷酸盐缓冲剂（pH6.5）平衡树脂。2、装柱：取直径为2.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理过的上述树脂悬浮液，关闭层析柱出口，带树脂沉降后，放过量的溶液，再加上一些树脂，至树脂沉积至15~20cm高度即可。与柱子顶部继续加入0.02mol/L的磷酸盐缓冲剂（pH6.5）平衡树脂。最终是流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持页面高出树脂表面1cm。溶菌酶的制备•装柱吸附：将上述蛋清液仔细加入到树脂顶部，打开出口使其缓慢流如注内，流速为1ml/min。•去杂蛋白：取出树脂，用柱平衡液洗去树脂上可能有的杂蛋白。在手机洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检测杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/LNaCl的pH值6.5、浓度为0.02mol/L磷酸钠缓冲液洗脱收集洗脱液！•聚乙二醇浓缩：将上诉洗脱液合并装入透析袋内，至容器外，外面附以聚乙二醇，容器加盖。酶液中的水分很快就透析到膜外，被聚乙二醇所吸收。然后所得浓缩液之后的透析袋用蒸馏水洗去透析袋膜外的聚乙二醇！小心取的浓缩版的溶菌酶溶液实验看法：•与教科书P488页制备方法不同的是：教材所选用的吸附方法使用磁力搅拌器搅拌蛋清液和树脂，个人觉得此方法可以用于样品较小的情况下，大约在300毫升以下！溶菌酶活力、蛋白浓度的测定•实验原理•实验仪器、材料及试剂•试剂配制•实验步骤溶菌酶活力、蛋白浓度的测定•实验仪器、材料及试剂：（一）仪器：721分光光度计(二)材料及试剂：溶菌酶，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，溶壁微球菌干粉，氯化钠，考马斯亮蓝G-250,95%乙醇，85%磷酸，牛血清蛋白（BSA）溶菌酶蛋白浓度的测定•实验原理：棕红色的染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，形成蓝色的复合物最大吸光度由465nm变为595nm。在一定蛋白浓度范围内，蛋白和染料的结合符合比尔定律。通过测定595nm处的光吸收值的增加量，可对蛋白质浓度进行定量测定。溶菌酶活力、蛋白浓度的测定•试剂的配制：1、测活缓冲液：含30mmol/LNaCl的0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH6.2。2、底物浓度：40mg溶壁微球菌干粉，荣誉100mL测活缓冲液中。3、考马斯亮蓝G-250试剂;考马斯亮蓝G-250100mL95%乙醇中，加入100mL85%盐酸，用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤。4、标准蛋白质溶液，用含有0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.0(缓冲液A)配制1mg/mL牛血清蛋白溶液。5、溶菌酶液配制：取上述实验中所获得的溶菌酶粗品液，荣誉100mL的测活缓冲液。溶菌酶蛋白浓度的测定•实验步骤•标准曲线的测定：取14支试管按下表，分两组进行平行操作：管号0123456标准蛋白溶液/mL0.000.010.020.030.040.050.06缓冲液A/mL0.100.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝G-250/mL5.005.005.005.005.005.005.00摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A295溶菌酶蛋白浓度的测定•按上表的数据，以A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。•测定未知样品的蛋白质浓度：测定方法同上。去合适的未知样品提及，使其测定值在标准曲线的线性范围内。根据所测定的A595值，在标准曲线上查处相当于标准蛋白的Laing，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）溶菌酶蛋白浓度的测定•实验备注：若样品浓度超出了标准曲线的线性范围，则适当加以稀释，稀释至标准曲线的线性范围之内的浓度！溶菌酶活力的测定•实验原理：本实验以溶壁微球菌为底物，通过测定细菌悬液浊度的变化（OD600）来测定溶菌酶的活性溶菌酶活力的测定•酶活力的测定：在室温下，取2个试管，分别在1号管中加入3.0mL测活缓冲液，2.5mL底物浓度；2号管中加入2.5mL测活缓冲液，2.5mL酶液。以2号管为对照，根据不同反应时间内在721分光光度计上每隔30s测定1号650nm处的吸光值。按下列表格记录是按结果：时间/s0306090120150180OD650溶菌酶活力的测定•实验数据处理酶活力单位（U）：没在温室pH6.2条件下，OD650每分钟强大0.001为1个酶活力单位U。比活力=活力单位/mg蛋白根据测得结果，计算各步数据填入下表：组分体积/mL蛋白/mg*mL-1总蛋白/mL活力/U*mg-1比活力/U*mg-1提纯倍数回收率1100%参考文献：•《生物与制药工程实验》主编：万海同浙江大学出版社P89-94•《生物制药工艺学》主编：吴梧桐中国医药科技出版社P488-489