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1猪人工授精新技术与操作安全朱士恩（中国农业大学动物科技学院北京100193）摘要：人工授精的效果与精液质量、输精方法及输精剂量等方面均具有重要相关性。精液的质量检测是人工授精过程中必不可少的程序。精液检测的主要目的就是快速、准确地鉴定精子质量，以提高受精能力。精液常规检测方法虽然已被广泛应用，但其在预测精子受精能力方面仍存在着主观性、误差高等缺点。因此，客观、准确的评价精子的状态及其受精潜能，对于科研和生产实践具有重要的意义。本文主要从精液质量的快速检测、检测指标与受精能力的相关性、人工输精方法的改进及操作安全等方面进行介绍，为实验室研究及生产安全操作提供理论与技术参考。关键词：精液；精液检测；人工授精；操作安全；猪国际上猪人工授精技术始于20世纪30年代，迄今为止其应用已有70多年的历史，我国在上世纪50年代初期也在生产中推广应用。人工授精不仅可以充分发挥优秀公猪的遗传潜力，也是选种选育的不可或缺的重要手段，同时还可以减少性传播疾病，加快繁殖速度，提高生产效率，获得更高的经济效益。但随着精液保存技术的发展，尤其是冷冻保存、低温保存及性控精液技术的发展，传统的输精方法及精液品质评价方法已不能够满足人工授精的需要，急需进行更新与改进，以进一步提高人工授精技术在养猪生产中所发挥的重要作用。客观、准确的评价精子的状态与受精潜能，对于科研和生产实践具有重要的意义。精子检测的主要目的是快速、准确地确定其受精能力。常规检测指标有：精液的颜色、气味、pH、精液量、精子的密度、精子的运动能力、形态和活率等，虽然这些指标的检测很重要，但其在预测精子受精能力方面受主观和客观因素的影响，误差很大。近年来，随着新的技术应用于精液品质检测，可以更加细致地对精子的特征进行评估。利用荧光染色技术可以对精子的微观功能进行检测，包括质膜完整性、获能状态和顶体状态等。而联合使用荧光染料，则可以同时检测精子几种功能指标。而流式细胞仪（flowcytometry，FCM）的应用，可以在短时间内分析大量的经荧光标记的精子，促进了荧光染色技术在精子质量评估中的应用。计算机辅助精子分析系统（computerassistedspermanalysis，CASA）可以检测精子活力和形态学上的特征，避免了光学显微镜评估的主观性和可变性缺点。通过检测精子与透明带或输卵管上皮的附着、精子穿透卵母细胞的能力，可以获得精子更真实的受精能力信息。精子的受精能力是受多种指标所控制，因而任何单独一种检测指标都无法完全反映其受精能力。只有综合检测与分析，才能更好地反映精子的受精能力。人工授精的效果除与精液质量相关外，还与输精剂量及方法有关。合适的输精剂量及输精方法可以显著的提高受胎率，尤其对于冷冻精液及性控精液。另外，猪精液冷冻也是影响受精效果主要因素之一。因此，在生产上提高精液保存效果，改进人工输精方法和操作程序仍是下一步的研究方向。1猪精子的特点1.1猪精液的理化特性正常公猪的精液单次射精量为200～500ml，密度为2～3亿/ml，颜色为乳白色或浅灰2色，呈云雾状，略带腥味，pH值为7.0～7.8。1.2猪精子的形态和结构猪的精子分头部、颈部和尾部等三个主要部分，长度约为50～60μm，表面有质膜覆盖，是含有遗传物质并有活动能力的雄性配子。1.2.1头部猪精子头部为扁卵圆形，长度约为8.5μm，长、宽、厚的比例约为8∶4∶1。猪精子的头部主要由细胞核构成，内含遗传物质DNA。核的前部，在质膜下为帽状双层结构的顶体（acrosome）。猪的精子核与顶体之间的核膜前部形成一个锥形突起，叫做穿卵器（perforatorium），有利于受精过程精子入卵。顶体内含多种与受精有关的酶类，稀释和冷冻操作过程中容易造成顶体损伤，导致受精率下降。1.2.2颈部猪精子的颈部是头和尾的连接部。颈部是精子最脆弱的部分，特别是精子在成熟、体外操作过程中，某些不利因素的影响极易造成尾的脱离，形成无尾精子。1.2.3尾部为精子最长的部分，是精子代谢和运动器官。是精子分解营养物质，产生能量的主要部位。精子主要靠尾部的鞭索状波动，推动精子向前运动。1.2.4畸形精子和分类根据猪精子出现畸形的部位，可分为头部、中段和尾部三类畸形。（1）头部畸形常见的有窄头、头基部狭窄、梨形头、圆头、巨头、小头、头基部过宽和发育不全等。头部畸形的精子多数是在睾丸内精子发生过程中，细胞分裂和精子细胞变形受某些不良环境影响引起的。对精子的受精能力和运动方式都有显著的影响。（2）中段畸形包括中段肿胀，纤丝裸露和中段呈螺旋状扭曲等。中段畸形多数是在睾丸或附睾发生。中段畸形直接影响精子的运动方式和运动能力。（3）尾部畸形包括尾部各种形式的卷曲、头尾分离、双尾、带有近端和远端原生质滴的不成熟精子。大部分尾部畸形的精子是精子通过附睾、尿生殖道和在体外不安全操作过程中导致的。尾部畸形对精子的运动能力和运动方式影响最为明显。2实验室精液质量检测对精子进行质量评估，不仅要进行常规检测，例如精液颜色、气味、密度、pH、活力、活率、畸形率等检测指标，而且要对精子的质膜、顶体的状态、线粒体功能、获能和染色质状态等指标进行检测。2.1颜色正常的精液是乳白色或浅灰色，呈云雾状，色泽愈浓，其透明度愈低，精子密度愈高。若带有绿色或黄色是混有脓液或尿液；带有浅红色或红褐色是含有血液，表明精液中有炎症物。2.2气味正常猪精液略带腥味，如有异常气味（恶臭味，炎症的一种表现），属于异常。2.3pH值以pH计或pH试纸测量。正常精液的pH值为7.0～7.8，呈中性或弱碱性。32.4采精量的测定公猪的采精量因品种、年龄、采集频率不同有较大的差异，一般公猪的一次射精量为200~500mL。若采精次数过多、公猪生殖机能减退、日常管理不当、采精技术不熟练等均可能造成采精量过少；一次采精量过多则可能是由于混入过多的副性腺分泌物及尿液等。采精后应尽量避免多次转导容器和使用不等温容器测量精液的体积，以减少精子的死亡。2.5精子运动能力的检测2.5.1目测估测法检测活率精子的活率是指精液在37℃条件下呈直线运动的精子占全部精子总数的百分率。是评定精液品质的重要指标。常规评定精子活率是用目测估测法，在显微镜下观察精子活率，按0.1～1.0的十级评分法进行评估。检查活率时应严格控制温度，须在37℃条件下进行。2.5.2计算机辅助分析法（CASA）检测精子运动参数。利用精子品质计算机辅助分析仪可以直接对猪精子进行活率、活力以及其它运动参数进行检测，主要包括轨迹速度（curvilinearvelocity,VCL）、平均路径速度（averagepathvelocity,VAP）、直线运动速度（straight-linevelocity,VSL）、直线性（linearity,LIN）、精子侧摆幅度（amplitudeoflateralheaddisplacement,ALH，LHD）等。这种检测方法具有迅速、准确、重复性好等优点。2.6精子密度检查精子密度指每毫升精液中含有的精子数量，是确定精液稀释倍数、评定精液品质的一个重要指标，正常公猪的精子密度为2～3亿/mL，有的可高达5亿/mL。检测精子密度的方法主要有估测法、血细胞计数法和精子密度仪法等。目前生产上主要以精子密度仪法为主。2.6.1估测法在显微镜下观察精子的分布，精子与精子之间的距离少于一个精子长度为“密”，其距离相当于一个精子的长度为“中”，其距离大于一个精子的长度为“稀”。此种方法主观性强，误差大，只能进行粗略的估计。2.6.2血细胞计数方法该方法最准确，但速度慢，生产实践中主要用于抽检精子密度。血细胞计数方法：①以微量加样器取具有代表性原精液200μL，用3%NaCl稀释10倍；②在血细胞计数板上放一盖玻片，取1滴稀释后的精液置于计数板的槽中，靠虹吸将精液吸入计数室内；③在高倍镜下计数5个中方格内的精子总数，将该数乘以50万，即得原精液每毫升的精子数（即精液密度）。2.6.3精子密度仪和计算机辅助系统这种方法使用方便，检查所需时间短，重复性好，结果比较准确，是目前人工授精中测定精子密度最适用的方法。2.7精子畸形率检测精子畸形率的高低对受精能力存在一定的影响。先前的研究指出，精液中畸形的精子比率过高将会降低精液的受精能力（Saacke,1970；Lavaraetal.,2005）。但对于畸形率过高的精液通过增加精液的用量也可以提高其受精效果（Saackeetal.,1994,1998,2000；Waltersetal.,2005）。4精子畸形率的测定可以用伊红或姬姆萨等染料对精子进行染色后用普通显微镜观察，或者用相差显微镜直接观察活精子的畸形率。2.8精子质膜完整性检测精子质膜是精子的基本组成部分。质膜的破裂会引起细胞内代谢酶、ATP等组分的流失，最终导致精子死亡（GrahamandMoce,2005）。目前用于对精子质膜完整性进行检测的染料很多，根据染色后的荧光性可分为非荧光染料和荧光染料两大类。2.8.1非荧光染料非荧光染料对精子质膜完整性进行检测的染色组合主要包括伊红—苯胺黑（eosin-nigrosin）染色、伊红—苯胺蓝（eosin-anilineblue）染色和苔盼兰—吉姆萨（trypanblue-giemsa）染色等。2.8.2荧光染料检测精子质膜完整性的荧光染料根据染色原理的不同又可分为两类：死精子特异性荧光染料和活精子特异性荧光染料。（1）死精子特异性荧光染料的原理是当精子质膜具有完整的功能时，染料不能进入精子内部，精子不能发出荧光；当精子的质膜受损时，染料才能进入精子内部与DNA结合发出荧光。死精子特异性荧光染料主要包括碘化丙锭（propidiumiodide，PI）、bisbenzimide（Hoechst33258）、溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）和溴乙啡锭二聚体（ethidiumhomodimer-1，EthD-1）等，其中PI最为常用。（2）活精子特异的荧光染料是膜通透性的染料，能进入细胞膜完整的精子。主要包括烟酸己可碱33342（Hoechst33342）、SYBR-14、羧基荧光素双醋酸盐(carboxyfluoresceindiacetate，CFDA)、羧基二甲基荧光素双醋酸盐(carboxydimethylfluo-resceindiacetate，CMFDA)、Carboxy-SNARF-1和SYTO-17等。目前主要采用SYBR-14和PI的联合染色再加上HOST检测对精子质膜进行检测。同时精子活力通常采用SYBR-14和PI染色法（Garneretal.,1994；1995）进行检测。2.9线粒体功能检测线粒体的功能状态对精子起着重要作用，因为精子的运动能力与线粒体的活性密切相关，整个精子代谢所需的能量主要由线粒体提供（GrahamandMoce2005）。因此线粒体的功能状态是精子功能质量的一个关键指标。活精子的线粒体上存在着跨膜电位，因此对线粒体活性的检测主要通过检测线粒体的跨膜电位变化进行。目前检测精子线粒体活性的荧光探针主要有R123（Rhodamine123）、MITO（MitoTrackerGreenFM）和JC-1等。R123是一种能渗透入细胞且带阳离子的荧光探针，发绿色荧光，当用R123孵育线粒体正常的精子时R123能渗透入细胞并沉积在细胞的线粒体上发出绿色荧光。如果精子线粒体损坏则不会发绿色荧光。MITO是一种新型线粒体探针，其原理是MITO在水溶液中并不发荧光，而当积聚在线粒体内，不论其膜电位如何皆发绿色荧光。JC-1在检测精子线粒体膜电位方面具有重要作用，在精子线粒体膜电位低时，发绿色荧光；当膜电位高时，发橙色荧光（Garneretal.,1997）。目前认为JC-1是检测精子线粒体5功能最适合的荧光探针。2.10获能和顶体检测2.10.1获能检测评判精子功能的另一个重要的指标是精子的获能状态。精子膜的获能状态改变很容易引起顶体反应的提前发生，以及精子受精能力的丧失（Harrison,1996）。尤其在精液冷冻过程中，温度、渗透压和冷冻稀释