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第1页共6页灵芝药材及饮片检验操作规程1、目的：规定了灵芝药材及饮片的检测方法和操作要求。2、范围：适用于灵芝药材及饮片的质量检测。3、职责：3.1、QC质检员严格执行本操作。3.2、QC负责人监督执行。4、内容：4.1、物料编码：Y30、YP304.2、引用标准：《中华人民共和国药典》（2010年版第三增补本）及《灵芝绞股蓝口服液标准转正申报资料》（灵芝药材质量标准）。4.3、标准：指标名称药材标准饮片标准性状应符合规定不规则厚片鉴别鉴别（1）、（2）、（3）应符合规定----检查杂质——不得过3.0%水分不得过17.0%不得过13.0%总灰分不得过3.2%----二氧化硫残留量不得过150mg/ｋg----浸出物不得少于3.0%----含量多糖以无水葡萄糖（C6H12O6）计，不得少于0.90%----三萜及甾醇以齐墩果酸（C30H48O3）计，不得少于0.50%----腺苷含腺苷（C10H13N5O4）不得少于0.01%----4.4、操作步骤：4.4.1外观：洁净、无霉变、无污染。4.4.2性状：符合《中华人民共和国药典》（2010年版第三增补本64页）灵芝“性状”项下规定。4.4.3鉴别：4.4.3.1照显微鉴别操作规程《SOP•JC•030•04-00》检查,本品粉末浅棕色、棕褐色至紫褐色。菌丝散在或粘结成团，无色或淡棕色，细长，稍弯曲，有分枝，直径2.5～6.5μm。孢子褐色，卵形，顶端平截，外壁无色，内壁有疣状突起，长8～12μm，宽5～8μm。4.4.3.2取本品粉末2g，加乙醇30ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取灵芝对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照《SOP文件名称灵芝药材及饮片检验操作规程版本号04文件编码SOP•QC•030•04-00修订号00第2页共6页•JC•013•04-00》薄层色谱法标准操作规程试验,吸取上述两种溶液各4ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-甲酸乙酯-甲酸（15:5:1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。4.4.3.3取本品粉末1g，加水50ml，加热回流1小时，趁热滤过，滤液置蒸发皿中，用少量水分次洗涤容器，合并洗液并入蒸发皿中，置水浴上蒸干，残渣用水5ml溶解，置50ml离心管中，缓缓加入乙醇25ml，不断搅拌，静置1小时，离心（转速为每分钟4000转），取沉淀物，用乙醇10ml洗涤，离心，取沉淀物，烘干，放冷，加4mol/L三氟乙酸溶液2ml，置10ml安瓿瓶或顶空瓶中，封口，混匀，在120℃水解3小时，放冷，水解液转移至50ml烧瓶中，用2ml水洗涤容器，洗涤液并入烧瓶中，60℃减压蒸干，用70%乙醇2ml溶解，置离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液。另取半乳糖对照品、葡萄糖对照品、甘露糖对照品和木糖对照品适量，精密称定，加70%乙醇制成每1ml各含0.1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照《SOP•JC•013•04-00》薄层色谱法标准操作规程试验，吸取上述两种溶液各3ul，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以正丁醇-丙酮-水（5:1:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以对氨基苯甲酸溶液（取4-氨基苯甲酸0.5g，溶于冰醋酸9ml中，加水10ml和85%磷酸溶液0.5ml，混匀），在105℃加热约10分钟，在紫外光（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置显相同颜色的荧光斑点。其中最强荧光斑点为葡萄糖，甘露糖和半乳糖荧光斑点强度相近，位于葡萄糖斑点上、下两侧，木糖斑点在甘露糖上，荧光斑点强度最弱。4.4.4检查：4.4.4.1杂质：照杂质检查法操作规程《SOP•JC•026•04-00》测定，不得过3.0%。按下式计算：M1杂质（%）=———×100%M式中：M：供试品的取样量(g),M1：检出的杂质量(g)。4.4.4.2水分：照水分测定法标准操作规程（《SOP•JC•003•04-00》第一法）测定，药材水分不得过17.0%；饮片水分不得过13.0%。按下式计算：(M+M1)-M2水分（%）=————————×100%文件名称灵芝药材及饮片检验操作规程版本号04文件编码SOP•QC•030•04-00修订号00第3页共6页M式中M1：干燥前已恒重的称量瓶的重量（g)；M2：干燥后称量瓶+供试品的重量(g)；M：供试品的取样量(g)。4.4.4.3总灰分：照总灰分检查法操作规程《SOP•JC•027•04-00》测定，总灰分不得超过3.2%。按下式计算：M2-M1总灰分（%）=————×100%M式中M1：灼烧前已恒重的坩埚的重量（g)；M2：灼烧后坩埚+残渣的重量(g)；M：供试品的取样量(g)。4.4.4.4二氧化硫残留量：照《SOP•JC•021•04-00》二氧化硫残留量测定法测定，二氧化硫残留量不得过150mg/ｋg。计算公式：（V1-V0）×C×0.032×1000二氧化硫残留量（mg/g）=————————————WV1为供试品消耗碘滴定液的体积（ml）；V0为空白消耗碘滴定液的体积（ml）；C为碘滴定液的浓度（0.01mol/L)；W为供试品的重量（g）；0.032为每1ml碘滴定液（0.01mol/L)相当的二氧化硫的重量（g）。4.4.4.5浸出物：照浸出物测定法标准操作规程（《SOP•JC•028•04-00》水溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，不得少于3.0%。按下式计算：(M2-M1)×N含量CX（%）=————————×100%M-[M×水分%]式中M1：蒸发皿恒重的重量(g)；M2：蒸发皿+浸出物干燥后重量(g)；M：取样量(g)；N：稀释倍数。4.4.5含量测定：4.4.5.1多糖：照紫外-可见分光光度法标准操作规程《SOP•JC•014•04-00》测定。对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含0.12mg文件名称灵芝药材及饮片检验操作规程版本号04文件编码SOP•QC•030•04-00修订号00第4页共6页的溶液，即得。标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml，分别置10ml具塞试管中，各加水至2.0ml，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液（精密称取蒽酮0.1g，加硫酸100ml使溶解，摇匀）6ml，立即摇匀，放置15分钟后，立即置冰浴中冷却15分钟，取出，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法标准操作规程《SOP•JC•014•04-00》在625nm波长处侧定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。供试品溶液的制备：取本品粉末约2g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水60ml，静置1小时，加热回流4小时，趁热滤过，用少量热水洗涤滤器和滤渣，将滤渣及滤纸置烧瓶中，加水60ml，加热回流3小时，趁热滤过，合并滤液，置水浴上蒸干，残渣用水5ml溶解，边搅拌边缓慢滴加乙醇75ml，摇匀，在4℃放置12小时，离心，弃去上清液，沉淀物用热水溶解并转移至50ml量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，取溶液适量，离心，精密量取上清液3ml置25ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。测定法：精密吸取供试品溶液2ml，置10ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6ml”起，同法操作，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含无水葡萄糖的重量（mg），计算，即得。计算公式：AX×N含量CX（%）=CR————————————×100%AR×（M×水分%）×1000式中：AX为供试品峰面积；CX为供试品的浓度（%）；AR为对照品的峰面积；CR为对照品的浓度(mg/ml)；M：取样量（g）；N：稀释倍数。本品按干燥品计算，含灵芝多糖以无水葡萄糖（C6H12O6）计，不得少于0.90%4.4.5.2三萜及甾醇：照紫外-可见分光光度法标准操作规程《SOP•JC•014•04-00》测定。对照品溶液的制备：取齐墩果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得。标准曲线的制备：精密吸取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml，分别置15ml具塞试管中，挥干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密称取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10ml，即得）0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，在70℃水浴中加文件名称灵芝药材及饮片检验操作规程版本号04文件编码SOP•QC•030•04-00修订号00第5页共6页热15分钟，立即置冰浴中冷却5分钟，取出，精密加入乙酸乙酯4ml，摇匀，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法标准操作规程《SOP•JC•014•04-00》在546nm波长处侧定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。供试品溶液的制备：取本品粉末约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加乙醇50ml，超声处理（功率140W，频率42kHZ)45分钟，滤过，滤液置100ml量瓶中，用适量乙醇，洗涤滤器和滤渣，洗液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。测定法：精密量取供试品溶液0.2ml，置15ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“挥干”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液齐墩果酸的含量，计算，即得。本品按干燥品计算，含三萜及甾醇以齐墩果酸（C30H48O3）计，不得少于0.50%计算公式：AX×N含量CX（%）=CR——————————————×100%AR×（M-[M×水分%]）×1000式中：AX为供试品峰面积；CX为供试品的浓度（%）；AR为对照品的峰面积；CR为对照品的浓度(mg/ml)；M：取样量（g）；N：稀释倍数。4.4.5.3腺苷：照高效液相色谱法标准操作规程《SOP•JC•001•04-00》测定，色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲溶液（PH6.5）[取0.01mol/L磷酸二氢钠68.5ml与0.01mol/L磷酸氢二钠31.5ml混合（PH6.5）]-甲醇（91:9）为流动相；检测波长为260nm。理论板数按腺苷峰计算应不低于2000。对照品溶液的制备：取腺苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1ml含0.04mg的溶液，摇匀，即得。供试品溶液的制备：取本品粉末（过二号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加50%甲醇10ml，密塞，摇匀，称定重量，放置过夜，超声处理1小时，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。计算公式：AX×N含量CX（%）=CR——————————————×100%AR×（M-[M×水分%]）×1000文件名称灵芝药材及饮片检验操作规程版本号04文件编码SOP•QC•030•04-00修订号00第6页共6页式中：AX为供试品峰面积；CX为供试品的浓度（%）；AR为对照品的峰面积；CR为对照品的浓度(mg/ml)；M：取样量（g）；N：稀释倍数。结果：本品按干燥品计算，含腺苷（C10H13N5O4）不得少于0.01%。4.5、结果判断：按上述标准检测，结果相符，判为符合规定。