梨种质资源的冷冻保存和长期保存

梨种质资源的冷冻保存和长期保存BARBARAM.REED,JEANINEDENOMA,JIELUO,YONGJIANCHANG,ANDLEIGHTOWILLUSDA-ARSNationalClonalGermplasmRepository,33447PeoriaRoad,Corvallis,Oregon97333-2521(B.M.R.);DepartmentofHorticulture,OregonStateUniversity,Corvallis,Oregon97331(J.D.,J.L.,Y.C.);USDA-ARSNationalSeedStorageLaboratory,1111SouthMasonStreet,FortCollins,Colorado80521(L.T.)(Received12December1997;accepted31March1998;editorT.A.Thorpe)摘要无性繁殖作物种质资源通常以植物的形式被保存在大田中、温室中以及密闭箱中。这些种质资源被安全的繁殖为繁殖植物或独立个体时，费用高昂，并且需要大量的空间。最近为了梨种质资源的长期存储而发展的冷冻保存技术可提供常规的种质资源收集维护的有效替代方案。梨（PyrusL.）种质资源现在可以存储为种子(物种)、休眠芽、田间种植的树木的花粉以及体外生长植物的茎。利用慢速冻结或体外生长茎尖玻璃化冷冻保存，梨种质资源现在可以长期（100年）低温保存和存储。休眠芽冻结，花粉、及其他行的种子超低温保存正在研究中以便完善的梨种质资源群体。在俄勒冈州科瓦利斯市国家无性系种质资源库基地，这种低温保存的群体为大田梨种质资源群体提供了基本储存。关键词：冷冻保存；种质库；液氮储存；梨；缓慢冻结；玻璃化冷冻保存简介世界各地的许多实验室都在研究植物种质资源的超低温保存。植物的储藏方式诸如种子、花粉、休眠芽和茎尖等都在被积极研究中。虽然遗传资源的保存被以农作物种子繁殖的方式而进行了很多年，但是有组织性的保护无性繁殖植物仅仅是在20年前才开始发展。许多国家已经吧种质资源保存作为优先事项来作高效率的研究。由于农业系统中的多样性的丧失以及原先孤立的农业社区开始使用新的栽植品种来替换旧的土地种植品种，使得种质保存变得越来越重要。野生近缘植物的遗传多样性对未来作物改良非常重要。因此，所有具有唯一性的补充种植资源都需要收集和保留。当为作物种植者进行作物强化方面的重要特点和分类的评价时有效的大田和体外收集可以为它们提供帮助。基本资源收集仅在有效收集缺失或重建时才会被储藏和使用（斯坦伍德，1985）。大多数种子的基础收集显示当在-20℃时他们的储藏寿命较长。无性繁殖的作物或大粒种植物因为植物高杂合性、无菌、短寿和温度或干燥敏感性所以必须作为营养植物材料而且是在标准条件下。无性繁殖作物的备用收集通常是在第二站点中的温室或体外收集的方式以大田收集的形式来进行。冷冻保存是对种质资源存储系统的最新补充。在液氮中存储的无性系材料基础集合是许多国家种质资源系统的一个目标。优点包括收集的安全性更高、空间要求小、维护的小投入和小支出以及在有效收集中所需重复数的减少。梨是一种经济上重要并且是无性繁殖的作物示例。位于科瓦利斯上午美国农业部农业研究所国家无性系种质资源库(NCGR)，或在其大田资源收集中有1500多个梨基因型。约160个基因型也以体外培养的方式存储在4℃下的低光环境，并且2-3年的间隔可以再生。30个基因型的花粉存储在液态氮中。液态氮中的存储提供稳定、少维护，低风险、长期的基础资源收集无性系梨种质资源和种子的梨品种。此基础资源收集现在已经在NCGR和位于柯林斯堡得国家种子贮藏实验室中进行。超低温保存研究关于梨种子、花粉、休眠芽以及以及体外生长的茎尖的冷冻保存的研究。以下是梨遗传资源冷冻保存研究综述。梨种质资源持续低温保存存储的详细信息也包括在内。这些研究报告表明冷冻保存在维护世界种质资源集合中的技术到位和可供使用。尽管在存储植物材料方面的技术比其他技术更加先进，但冷冻保存应适用于梨遗传资源，以确保未来的可用性。梨种质资源超低温保存种子。没有关于梨种子超低温保存的报告。Stanwood(1985)建议最耐旱耐液态氮且水分含量在5到10%、冷却速率为1至30℃/min之间种子有高存活率。如果不损坏测试样本，可以安全地存储整个样本。需要研究以确定可用种质资源集合中的许多梨物种的种子的最佳种子水分含量和冻融率。花粉。梨花粉的许多研究报告显示它长寿命。干梨花粉可以在干燥室温条件下存活（低萌发率）长达9年之久（秋滨和大村，1986年）。Visser（1955年）在各种温度和相对湿度的条件下做了广泛的梨花粉存活研究，发现在-196℃下梨花粉的发芽能力可以保持2-3年。秋滨（1978年）成功地低温保存并干冻化梨花粉，发现干燥存储的梨花粉在授粉前的再水化是很重要的。那些在液态氮中储存了三年以及在6小时的的5℃,90%相对湿度下复水的花粉均成功授粉，Craddock(1987)低温储存了很多来自各种梨品种的花粉。他发现在解冻后花粉管发芽上的一些变异，但总体上时好的变异结果。Craddock收集了还未开放的、处于“爆米花阶段”的樱花，并且用密闭筛从花上分离了花药；未裂开的花药一夜之间在实验台上干燥开裂。风干后的花粉初始含水量（MC）是25%到35%，并有85%到95%的萌发率。花粉在液态氮中暴露后含水量在5%-30%之间的反映出最大活性，而有这一含水量的花粉的适度萌芽率高达90%。花粉花药混合物在经过24小时干燥后可以进行低温储存，在低温储存之前也可以在5℃的干燥器内储存。Chen等人发现（1993年）在每此花粉被冻结时如果水分含量仍然较低（10至20%），那么在几个冻结/解冻周期后梨花粉仍然可用，甚至还成功的进行了授粉。体外萌发也可能用于可行性测试（Towill，1985年)。休眠芽。酒井和西山（1978年）第一次证明hardy梨休眠芽在-40℃-50℃的预冷后可以在液态氮中生存。被测试的四分之五的品种有高存活率(78到100%)和高发芽率，虽然所有品种的木质部均受到严重伤害。日本的一些实验室已经研究了从休眠芽上切取的茎尖的冷冻保存(Moriguchietal.,1985;Okaetal.,1991;MiandSanada,1992,1994)。Moriguchi等人（1985）和Moriguchi（1995）报告要想成功的冷冻保存从日本梨[P.serotinaRehd.var.cultacv.Kosui;synonymofP.pyrifolia(Burro.f.)Nakai]的休眠芽上截取的茎尖部二甲基亚砜（dmso）的预处理和-40℃至-70℃的预冷处理时必须的。其他的冷冻保护剂并不是必须的，而且在没有复温过程的应用下80%的茎尖可以生存。Oka等人（1991）在冻存的“Senryo”冬芽中发现了一些完整的植物，但嫁接后芽结构的整体频率较低(0%-8%)。Suzuki等人（1997年）将冬梨（PyruscommunisL.cv.Beurred'Amanlisand其他12个梨基因型）的芽脱水、低温处理，最后微嫁接到具有良好再生能力的砧木上。离体茎尖。第一个体外梨茎尖超低温保存系统被Reed(1990)andDereuddre等人(1990a,1990b)同时发展起来。Reed(1990)发明了一种慢速冷冻技术。冷驯化（CA）和缓慢冷却致使被低温保存的四个梨品种的茎再生率较高（55%-95%）。在解冻后的再生率上物种差异是很明显的。P.communiscv.BeurreHardyandP.cossoniiRheder有95%，P.koehneiC.Schneider有75%，而thehybridP.dimorphophyllaMakinoXP.faurieiC.Schneider,hybrid有55%。梨试管苗在1wk（22℃,8小时光照或-1℃，16小时黑暗）条件下可以被冷驯化。茎尖先在有5%的二甲基亚砜介质中被预处理，然后在液态氮暴露前以0.1、0.3、0.5或0.8℃/min的速度降至-40℃并在在冷冻保护剂PGD[10%聚乙二醇(MW8000）、葡萄糖和二甲基亚砜的液体介质]中冷冻，然后再在40℃的水中水浴1分钟。在不同的冷冻率下不同的物种反应各不相同，但总体上说冷冻速率越慢，再生率越高。冷驯化是所有被测试的基因型高再生率的必要条件。Dereuddre(1990a,1990b)等人对BeurreHardy茎尖发展了一个封装脱水技术。从冷驯化试管苗种提取2mo茎尖，装在海藻酸钙凝胶珠中，先在一个含0.75摩蔗糖的液体介质中预处理18个小时，再在空气流动机中脱水2-6个小时，海藻酸钙凝胶珠被直接浸泡在液态氮中而迅速冷却，又在室温条件下在空气中慢慢复温，3小时的脱水导致了高的存活率（80%）；存活茎尖中的40%形成了新植株，在后来的一项研究中在0.75的蔗糖中预处理并进行4小时的脱水中得到了最好的结果（80%的茎再生），导致了20%的残留水（Scottezetal.,1992）。NiinoandSakai(1992)用封装脱水技术对三个梨品种（P.pyrifoliaandP.communis)进行处理从而得到了70%的茎结构。试管苗被冷驯化到了3wk；然后茎尖在较高浓度蔗糖介质中成功的被切除和预处理，在藻酸盐珠中被捕获并在5℃下在1摩蔗糖中进行16个小时的预培养，最后在硅胶中脱水至33%然后浸泡在液态氮中。Niino等人成功的利用玻璃化冷冻方法对8个梨品种(P.pyrifoliaandP.communis)进行了处理并得到了40%-72.5%的梨结构。体外生长的茎尖在5℃、8小时光照下损失了3wk的含水量。离体的茎尖在0.7M的蔗糖介质中被预处理了1天，紧接着是在冻存管中的植物玻璃化冷冻液2(PVS2)中浸泡20分钟。Pvs2的两个改变使液态氮中浸泡的时间缩短了70分钟。茎尖随后在35℃的水浴中复温，并在没有硝酸铵的MS培养基（MurashigeandSkoog，1962）中再生。种质资源存储。为了测试梨基因型的缓慢冷冻(Reed,1990)和玻璃化冷冻保存技术(修改自Yamada等人，1991).的低温保存的潜力，科瓦利斯的美国农业部农业研究所国家无性系种质资源库对许多梨基因型进行了筛选。目的是以茎尖（0.8MM）浸泡在液态氮中为储存方式的梨种质资源基础资源库。增加的资源从体外资源库中随机选择，并且根据冷冻保存技术进行筛选。体外培养的试管苗在22℃、8小时光照(3微mol*m-2*s-1)和-1℃、16小时夜处理的恒温箱中得到了含水量的1WK，并且可以根据任意上述任一以项技术而进行茎尖切除。使用REED（1990）发明的缓慢冷冻方式，我们在添加5%二甲基亚砜和2.05g固化剂的介质中在CA孵化器中对0.8MM的茎尖进行了2天的预处理，然后将他们转移到具有0.25毫升液体培养基的1.2毫升塑料冻存管中。冻存管在半小时内被冷冻保护剂PDG[10%聚乙二醇(MW8000）、葡萄糖和二甲基亚砜在液体介质中的]填满。样品被容许在4℃下平衡30分钟，然后提取冷冻保护剂1ml。样本被冷冻在受控制的率冰箱（CryoMed、变型科学、俄亥俄州的玛丽埃塔)中，率冰箱以放热诱导的方式以每分钟0.1℃的降至-9℃.然后以同样的速度继续降温至-40℃，冰箱中的样品一致浸泡在液态氮中。样品线是在45℃的水中加热一分钟，然后再在22℃的水中加热一分钟，然后在液体介质中冲洗，最后在程氏介质(Cheng,1979)中电镀。梨茎尖可以被一种为白三叶草而发明的改良技术(Yamada等人,1991)所玻璃化。茎尖先是以在缓慢冷冻中进行预处理的方式被预处理，然后被转运到放在冰中的含有冷冻保护剂pvs2（30%甘油、15%乙二醇、和液体培养基与0.4M蔗糖15%二甲基亚砜）的1.2ml的塑料冻存管中，然后搅拌。20分钟后，冻存管被浸泡在液态氮中。样本仍然以在缓慢冷冻中进行的加热方式进行加热，然后在有1.2M蔗糖的液体MS介质