植物代谢组学

植物代谢组学汇报人：时间：2015年12月11号目录•植物代谢组学的研究背景与意义•植物代谢组学的研究方法•代谢组学在植物学中的应用•前景与展望是研究一个生物系统中所有组分成分（基因、mRNA、蛋白质等）的构成，以及在特定条件下这些组分间的相互关系的学科。一：研究背景与意义“基因组学反映了什么是可以发生的，转录组学反映的是将要发生的，蛋白质组学指出了赖以发生的，只有代谢组学才真正反映了已经发生的。”-------许国旺代谢组：是指细胞或者生物体内的所有代谢物的总和，也有人将它定义为细胞、组织、器官或者生物体内的所有小分子代谢组分（主要是相对分子量1000以内的内源性小分子）的集合。代谢组学：是通过考察生物体系（细胞、组织或生物体）受到刺激或扰动后（如将某个特定的基因变异或者环境变化后），其代谢产物的变化或随时间的变化，来研究生物体系的一门科学-------许国旺2008靶向分析方法非靶向分析方法代谢组学药物研发分子生理学生分子病理学基因功能组学营养学环境科学其他代谢组学的应用领域指数增长，高影响因子学术刊物上发表的论文较多，仅nature系列刊物论文就达到20余篇，核心论文引用率高，其中引用50次以上的有50多篇，100次以上的有11篇与转录组学和蛋白质组学相比，代谢组学的优点：1、基因与蛋白质表达的微小变化会在代谢物上得到放大，从而使检测更容易2、代谢组学的研究不需要建立全基因测序及大量序列标签（EST)的数据库3、代谢物的研究种类远小于蛋白质的数目4、研究中采用的技术通用代谢组学分析流程包括：1.样品的制备（-80℃下保存）2.成分分析与鉴定3.数据分析与解释由于植物中代谢物的种类繁多，而目前可用的成分检测和数据分析方法又多种多样，所以根据研究对象不同，采用的样品制备、分离鉴定手段及数据分析方法各不相同。二：代谢组学的研究方法获得相应的生物标志物群，发现未知代谢途径，从而揭示生物体在特定时间、环境下的整体功能状态，为解释生命体的内在规律提供信息和线索植物代谢物样品制备分为组织取样、匀浆、抽提、保存和样品预处理等步骤。目前还没有适合所有代谢物的提取方法，通常只能根据所要分析的代谢物特性及使用的分析手段选择合适的提取方法，而提取时间、温度、溶剂组成和质量及实验者的技巧等诸多因素也对样品制备产生很大影响。在分析之前通常用固相微萃取，固相萃取和亲和色谱等方法进行预处理。1、样品的制备•挥发性成分（VOCs）是植物代谢组中的一类关键致香成分对于挥发性样品可以采用顶空固相微萃取、动态顶空采集法的新技术进行样品采集。涂有特殊吸附材料(活性炭、Tenax系列、Propak系列、等)的石英纤维顶空固相微萃取操作过程泵吸附管净化的空气代谢组学的技术平台红外线光谱技术（IR)稀薄气液色谱技术（TLC)高效液相色谱技术（HPLC)高效毛细管电泳技术（HPCE)毛细管电泳与紫外线吸光率检测联用技术（CE/UV)毛细管电泳与激光诱导荧光检测联用技术（CE/LIF)液相色谱与质谱先后使用技术（LC/MS/MS)液相色谱与质谱和核磁共振技术功用(LC/NMR/MS)气相色谱和质谱联用(GC/MS)液相色谱和质谱联用(LC/MS)毛细管电泳与质谱联用（CE/MS)核磁共振技术(NMR)以及傅里叶变换红外、光谱与质谱联用(FTIR/MS)目前最常用的分离分析手段2、成分分析与鉴定色谱原理：色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。柱色谱图色谱气相色谱(GC)液相色谱(LC)气固色谱(GSC)气液色谱(GLC)柱色谱液固色谱液液色谱离子交换色谱空间排阻色谱正相分配色谱亲和色谱反相分配色谱平板色谱薄层色谱TLC纸色谱TLC电色谱平面层电色谱毛细管柱电色谱毛细管电泳毛细管区带电泳毛细管凝胶电泳毛细管胶束电动色谱毛细管等电聚焦毛细管等速电泳超临界色谱(SFC)气相色谱仪气路系统进样系统分离系统温控系统检测记录系统高效液相色谱法原理高效液相色谱仪纸色谱分离叶绿素薄层色谱质谱原理：质谱分析是一种测量离子荷质比（电荷-质量比）的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。质谱仪的基本结构及工作流程进样系统离子源电子轰击电离（EI）化学电离（CI）解吸电离（DI）喷雾电离（SI）质量分析器扇形磁场飞行时间质量分析器四极杆质量分析器四极杆离子阱离子回旋共振质量分析器电子倍增管及其阵列离子计数器感应电荷检测器法拉第收集器检测器计算机控制与数据处理质谱仪种类非常多，工作原理和应用范围也有很大的不同。从应用角度，质谱仪可以分为下面几类：有机质谱仪：气相色谱-质谱联用仪（GC/MS)液相色谱-质谱联用仪（LC/MS)其他有机质谱仪，主要有：基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪（MALDI-TOFMS)，富立叶变换质谱仪（FT-MS）无机质谱仪：火花源双聚焦质谱仪（SSMS）感应耦合等离子体质谱仪（ICP-MS)二次离子质谱仪（SIMS)气相色谱和质谱联用（GC/MS)液相色谱和质谱联用（LC/MS)GC/MS和LC/MS可以同时检测出数百种化合物，包括糖类、有机酸、氨基酸、脂肪酸和大量不同的次生代谢物。GC/MS有很好的分离效率且相对较为经济，但需要对样品进行衍生化预处理，这一步骤会耗费额外的时间，甚至引起样品的变化。GC/MS无法分析膜脂等热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。LC/MS中目前应用较广的是高效液相色谱和质谱的联用（HPLC/MS)。HPLC和GC原理相似，但通常不需要衍生化，只需要式样能够制成溶液，因此不受样品挥发性的限制。对于高沸点，热稳定性差、相对分子质量大的有机物理论上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。HPLC/MS选择性和灵敏度都较好,但分析的时间相对较长,且需依赖纯的参照物。•衍生化是一种利用化学变换把化合物转化成类似化学结构的物质。样品的衍生化的作用主要是把难于分析的物质转化为与其化学结构相似但易于分析的物质，便于量化和分离。色谱质谱联用技术具有分离效率高、灵敏度好以及经济实用等优点。但需要解决的主要问题是：大量色谱峰的识别问题以及方法的重现性问题。毛细管电泳与质谱联用CE/MS分离样品效率比普通的色谱质谱联用要高得多，仅需要极少的进液量，而且其测试时间短，试剂成本低。CE/MS在微生物代谢组领域发挥着越来越重要的作用。成就Roessner等（2000,2002a,2001b)利用GC/MS对马铃薯（Solanumtuberosum‘Desiree’)进行高通量代谢物分析，同时检测到150种化合物，其中77种被鉴定为氨基酸、有机酸或糖。利用GC/MS进行代谢组学研究的代表性工作是Fiehn等（2000）的一系列有关植物代谢的研究。他们用GC/MS对模式植物拟南芥的叶子提取物进行了研究，定量分析了326个化合物，并确定了其中部分化合物的结构。Fiehn(2003)利用HPLC/MS检测笋瓜（Cucurbitamaxima‘GelberZentner’)叶柄和叶片抽提物，检测到了超过400种代谢物，有90种被定性，其中大部分是氨基酸、糖和糖苷。Huhman和Sumner(2002)在紫花苜蓿（Medicagosativa,PolishvarietyKleszczewska)和蒺藜状苜蓿（Medicagotruncatula)中各鉴定出15和27个皂角甙，并在紫花苜蓿中找到了2个新的乙二酸皂角甙。Tolstikov等(2003)用CE/MS对拟南芥进行代谢组分析,分离效果远远超过了Fiehn等用GC/MS进行的先期工作,检测到超过700个不同的色谱峰值,其中包括许多以前未检测到的脂类化合物及次生代谢物。核磁共振（NMR）核磁共振原理：指具有磁矩的原子核在高强度磁场作用下，可吸收适宜频率的电磁辐射，由低能态跃迁到高能态的现象。如1H、2D、13C、15N等原子核，都具有非零自旋而有磁矩，能显示此现象。优点：能够对样品实现非破坏性、无偏向性，分析结果具有良好的客观性和重复性。缺点：检测灵敏度较低，检测动态范围有限，很难同时检测同一样品中含量相差很大的物质。NMR磁体探头永久磁铁电磁铁超导磁铁Ward等(2003)用1H-NMR对多种不同生态型的拟南芥进行了代谢组分析,在碳水化合物和脂肪族物质中都发现了差异,说明了植物代谢物和生态型差异的相关性。Hyung-Kyoon等(2004)用1H-NMR对野生型和过表水杨酸合成基因的转基因烟草（Nicotianatabacum)的叶片和叶脉进行了研究,通过进TMV嫁接和对照实验,得到多个峰值变化,大部分峰被鉴定为氯原酸、苹果酸和糖。此实验提供了一种有效的不需过多步预处理程序的区分野生型和转基因植物的方法。成就傅里叶变换红外光谱与质谱联用(FTIR/MS)FTIR的工作原理：当样品经过红外光（通长波长在0.8-25μm，4000-400/cm)的电磁辐射作用之后，在一定的波长下，化学键吸收光能通过不同的方式发生键的震动（拉伸或弯曲震动），并利用这些分子中光的吸收和化学键的振动来鉴别代谢物组分。优点：扫描速度快、光通量大、高分辨率、高信噪、测定光谱范围宽。缺点：不可区分异构物，且组分片段和一些络合离子也对其有影响，由于离子抑制不能进行定量分析。成就Aharoni等(2002)利用高分辨率的FTIR/MS联用仪器对凤梨草莓(Fragariaananassa)组织进行了分析,依据不同的质荷比找到了5848个不同质量的物质,并根据对化合物中高含量的元素的精确质量测定估计了其中一半以上物质的化学结构式。统计学数据分析无监督方法有监督方法非线性映射NLM聚类分析HCA主成分分析PCA偏最小二乘法PLS偏最小二乘法-判别分析PLS-DA软独立建模分类法SIMCA人工神将元网络ANN常用4、海量数据分析在不知任何相关知识背景的前提下对样本信息进行分类，把具有相似特征的目标数据归在相同的源里，并用相应的可视化技术直观的表达出来。在已有知识和假设的基础上，建立信息组，然后利用所建立的信息组对未知数据实行识别鉴定、归类查找和预测。谱图解析数据处理聚类分析：就是把事物按其相似程度进行分类，并找出每一类事物共同特征的分析工具。聚类分析过程通常可分为以下步骤：数据收集并且收集相应的变量产生一个相似矩阵决定把目标总体细分为几类对每一种类别相应的定义实施聚类分析产生结果图三组水稻代谢物原始数据的聚类分析结果红色线条代表武汉的转人血清白蛋白基因的水稻代谢物样本蓝色线条代表武汉TP309水稻代谢物样本黄色线条代表海口TP309水稻代谢物样本(左)未过滤数据的聚类分析结果(右)过滤后数据的聚类分析结果主成分分析：是目前应用最为广泛的多维分析方法之一。PCA的特点是将分散在一组变量上的信息集中到某几个综合指标,即主成分(principalcomponent,PC)上,利用这些主成分来描述数据集内部结构,实际上也起着数据降维的作用。主成分是由原始变量按一定权重经线性组合而成的新变量。这些变量具有以下性质:1、每一个PC之间都是正交的;2、第1个PC包含了数据集的绝大部分方差,第2个次之,依此类推。图三组水稻的主成分分析结果的得分图红色三角形代表武汉的转人血清白蛋白基因的水稻代谢物样本蓝色菱形代表武汉TP309水稻代谢物样本棕色圆形代表海口TP309水稻代谢物样本(左)二维得分图(右)三维得分图红色三角形代表武汉的转人血清白蛋白基因的水稻代谢物样本蓝色菱形代表武汉TP309水稻代谢物样本棕色圆形代表海口TP309水稻代谢物样本图三组水稻的偏最小二乘分析三维得分图•在信息时代,利用网络资源进行研究是必不可少的。而对千头万绪的植物代谢物研究,建立相应的网上数据库也是势在必行的。这些数据库的建立也有利于