植物基因组DNA提取步骤

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植物基因组DNA提取实验操作步骤1取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg,加入液氮充分研磨。(植物细胞有细胞壁,液氮可以让细胞冷冻起来,变得很脆,这样容易破细胞壁。同时,液氮的超低温可以大大降低酶活性,防止降解。注:1、液氮的温度是-196℃,不要冻伤自己的手,带上手套。2、用一个保温杯,大一点的,把液氮取出来放在保温杯里,盖上盖子。3、然后用液氮将研磨棒和研钵预冷。4、将样品快速放入研钵中,快速研磨,在液氮挥发完之前再加入液氮,一定不要让液氮挥发完或者样品呈现那种黏糊的状态,这样样品中DNA容易降解。5、等到样品呈现细粉末状态了基本就可以了,用药勺把样品迅速舀到1.5ml离心管里。)2将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇,使其终浓度为0.1%),迅速颠倒混匀后,将离心管放在65℃水浴20min,水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。(水浴时间依实验具体情况而定,看样品裂解情况,具体看裂解液变得清澈透明为止)3加入700μL氯仿,充分混匀,12,000rpm(~13,400×g)离心5min。注:若提取富含多酚或淀粉的植物组织,可在第3步前,用酚:氯仿/1:1进行等体积抽提。4小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中,加入700μL缓冲液GP2,充分混匀。5将混匀的液体转入吸附柱CB3中,12,000rpm(~13,400×g)离心30s,弃掉废液。(吸附柱容积为700μL左右,可分次加入离心。)6向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(~13,400×g)离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。7向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),12,000rpm(~13,400×g)离心30s,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中。8重复操作步骤7。9将吸附柱CB3放回收集管中,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意:这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。10将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE,室温放置2-5min,12,000rpm(~13,400×g)离心2min,将溶液收集到离心管中。注意:洗脱缓冲液体积不应少于50μL,体积过小影响回收率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内(可以用NaOH将水的pH值调到此范围),pH值低于7.0会降低洗脱效率;且DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率,可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中,室温放置2min,12,000rpm(~13,400×g)离心2min。

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