搜索
备注：培养基和激素母液配制方法（1）母液配制时，先向容量瓶中注入1/3定容体积的蒸馏水，再一一称取各种盐放入烧杯中溶解，装入容量瓶，不得一次称取所有盐，混合溶解！在配制大量母液时，氯化钙最后加入。（2）200×Fe盐溶液称取1.39gFeSO4•7H2O溶于水（A液）；称取1.865gNa2•EDTA溶于热水（B液）；将A液缓慢倒入正在加热的B液中，加水接近250ml，煮沸，混合液颜色变深，冷却到室温，定容到250ml后,置于棕色试剂瓶内4℃保存。（3）0.5mg/ml2,4-D母液的配法称取50mg2,4-D，置于小烧杯内；加少量无水乙醇或95%乙醇使之完全溶解；加水定容至100ml，4℃保存。如果出现沉淀，需要重新配置。（4）0.5mg/mlα-NAA母液的配法称取100mgNAA置于小烧杯内；用1N的KOH溶液溶解NAA；用水定容至200ml，4℃保存。（5）0.5mg/ml6-BA母液的配法称取100mg6-BA置于小烧杯中；加少量的浓盐酸，用玻棒研磨成糊状，再加入少量浓盐酸，使之完全溶解；用水稀释并定容至200ml，4℃保存。（6）100mM乙酰丁香酮（As）的配制称取196.2mgAs，用5mlDMSO直接溶解，再加水定容至10ml，过滤灭菌后，分装入无菌小管，-20℃冰冻保存。使用前加入灭菌培养基。（7）0.5mg/mlKT和ABT的配法称取50mgkenetin或ABT生根粉，先用少量1NKOH溶解，再用水稀释定容至100ml，4℃保存。（8）其他附加物的溶解及配制A、称取吗啉乙磺酸（MES）5g溶于水中，定容至10mL。4℃保存。B、称取1gL-半胱氨酸(Cys)溶于2mL0.2mol/L或10%的NaOH溶液,用蒸馏水稀释定容至10mL，现用配制。4℃保存。C、称取850mg硝酸银，用蒸馏水溶解后定容至100mL。4℃保存。D、头孢霉素（cefotaxime）2500mg，用蒸馏水溶解后定容至10mL。4℃保存。E、潮霉素（HygB），商品已溶解，筛选时一般加5、8、12mg/L梯度浓度。植物培养的其他相关知识：培养基culturemedium是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。在植物组织培养历史进程中，事实上也紧密地伴随着培养基的研制史。对植物的营养要求的不断认识，对已有培养基的改进，或者将新发现的植物激素、新的有益成分应用于培养基之中，都大大促进了组织培养研究的迅速发展，取得越来越多的成功。一、培养基的种类和成分（一）培养基的种类培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改良称作改良培养基，目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：(1)MS培养基它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。(2)B5培养基是1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。(3)White培养基是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。(4)N6培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KN03和(NH4)2S04含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。(5)KM-8P培养基它是1974年为原生质体培养而设计的。其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。常用培养配方见表3-1。（二）、培养基的成分培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。1．水水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质'大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。2、无机元素(inorganicelement)大量元素，指浓度大于0．5mmol／L的元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。其作用是：(1)N在制备培养基时以N03-N和NH4-N两种形式供应。(2)P是磷脂的主要成分。常用的物质有KH2P04或NaH2P04等。(3)K制备培养基时，常以KCl、KNO，等盐类提供。(4)Mg、S和Ca、它们常以MgS04·7H20提供、CaCl2·2H20提供。微量元素指小于0．5mmol／L的元素，Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。3．有机化合物(organiccompound)培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类：(1)碳水化合物最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。高压灭菌时一部分糖发生分解、制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。(2)维生素(vitamin)这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。主要有Vsl(盐酸硫胺素)、VD6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、VC(抗坏血酸)、有时还使用生物素、叶酸、VB2等。一般用量为0．1-1．Omg／L。有时用量较高。Vm对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。(3)肌醇(myo-inosit0l)又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。使用浓度一般为lOOmg／L，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。(4)氨基酸(aminoacide)是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸、谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它们是牛乳用酶法等加工的水解产物，是含有约20种氨基酸的混合物，用量在10-1000mg／L之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。4．植物激素(hormone)是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物激素是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。(1)生长素类(auxin)在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。在促进生长方面，根对·生长素最敏感。在极低的浓度下，(10-5-10-8mg／L)就可促进生长，其次是茎和芽。天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。在植物体内也易受到体内酶的分解。组织培养中常用人工合成的生长素类物质。IAA(indoaceticacid吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的IAA分解酶降解，受光也易分解。NAA(naphthaleneaceticacid萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。IBA(indolebutyricacid吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。生长素配制时可先用少量95％酒精助溶。2，4-D可用0．1mol／L的NaOH或KOH助溶。生长素常配成1mgdml的溶液贮于冰箱中备用。(2)GA(gibberellicacid赤霉素)有20多种，生理活性及作用的种类、部位、效应等各有不同、培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素／赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化；此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。赤霉素溶于酒精，配制时可用少量95％酒精助溶。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70％-100％失效，应当采用过滤灭菌法加入。(3)细胞分裂素类(cytokinin)这类激素是腺嘌呤的衍生物，包括6-BA(6-苄基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激动素)、n(zeatin玉米素)等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素／生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。②促进细胞分裂与扩大。③抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、是长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。生长调节物质的使用甚微，一般用mg／L表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0．05-5mg／L，细胞分裂素0．05-10mg／L。5，培养材料的支持物(1)琼脂(agar)在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂的用量在6-10g／L之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。(2)其他有玻璃纤维、滤纸桥、海绵等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。6．抗生物质(antibiotic)抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5-20mg／L之间。添加抗生物质可防止菌类污染，减少培养中材料的损失，尤其是快速繁殖中，常因污染而丢弃成百上千瓶的培养物，采用适当的抗生素便可节约人力、物力和时间。尤其对大量通气长期培养，效果更好。7、抗氧化物(antioxide)抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸及Vc，可用50-200mg／L的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤灭菌后加入固体培养基的表层。其他抗氧化剂有二硫苏糖醇、谷胱甘肽、硫乙醇、及二乙基二硫氨基甲酸酯等。8、活性炭(activecarbon)使用浓度为0．5-108／L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。茎尖初代培养，加入适量活性炭，可以吸附外植体产生的致死性褐化物；其效力优于Vc和半胱氨酸；在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，但其作用有一个阀值，一般为0.1％-0．2％，不能