植物源农药的提取分离及结构鉴定修改版.

植物源农药的提取分离及结构鉴定张龙来Email：[e-mail]2014.10.20•一、基本概念•1、提取：利用适当的溶剂或方法，将所要成分尽可能从原料中完全提出的过程。•2、分离：将提取物中所含的各种成分一一分开，并将得到的单体加以精制的过程。第一节植物源农药的提取水亲水性有机溶剂亲脂性有机溶剂二、提取方法超临界流体萃取法（SFE）水蒸气蒸馏法溶剂提取法升华法压榨法溶剂•（一）溶剂提取法•根据天然成分的溶解性不同，选用对所需成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，将所需成分从生物材料中溶解出来的一种提取方法。溶剂提取是指溶剂进入生物体细胞，溶解或分散其有用物质而变成浸出物的全过程。包括浸润、解吸和扩散三个阶段。1、溶剂提取法的原理选择溶剂依据相似相溶原理。浸润：渗透阶段溶剂通过细胞壁渗透到细胞中。解吸：溶解阶段细胞内容物与细胞组织之间有亲和力，溶剂破除这种亲和力。扩散：置换阶段利用细胞内的渗透力产生的压差而抽提出来，用溶剂占领内容物的位置而将内容物置换出来。扩散过程表达式：dtdxdcDFdsdt:扩散时间F：扩散面积，以粉碎度表示浓度差dxdcD：扩散系数rNRTD61ds:在dt时间内的扩散量•2、选择溶剂的要点*对所要成分溶解度大*沸点适中容易回收*低毒安全*廉价天然产物成分中，萜、甾等大环、稠环化合物极性小，易溶于氯仿、乙醚等；糖、苷等易溶于水、乙醇等极性溶剂中；酸碱性成分因存在状态不同溶解性不同。最常用的溶剂为乙醇。•3、溶剂的分类*强极性溶剂：水*亲水性有机溶剂：能与水任意混溶（甲醇、乙醇、丙酮）*亲脂性有机溶剂：不与水任意混溶，可分层（正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、环己烷、石油醚）常用溶剂的极性大小顺序：石油醚四氯化碳苯氯仿乙醚乙酸乙酯正丁醇丙酮乙醇（甲醇）水4、化合物的结构与亲水性、亲脂性的关系•（1）分子结构中亲水性基团（羧基、羟基、氨基）越多，极性越大，亲水性越强，反之则亲脂性越强。•（2）分子中非极性部分越大，碳链越长或结构越大，则亲脂性越强。•（3）结构母核相同的成分，分子中功能基的极性越大，或极性功能基数量越多，则整个分子的极性越大，亲水性越强，亲脂性越弱。•5、溶剂的选择•(1)水：为价廉、易得、使用安全的强极性溶剂。适于提取无机盐、糖、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐、苷类等。•(2)亲水性有机溶剂：以乙醇最常用。高浓度提取亲脂性成分，低浓度提取亲水性成分。•(3)亲脂性有机溶剂：•具有较强的选择性，对挥发油、油脂、叶绿素、树脂、内酯、某些生物碱及一些苷元均可提取出来。优缺点：沸点低，浓缩回收方便，但易燃、有毒、价贵，穿透力差。6、溶剂提取的方法溶剂提取的方法连续回流提取法煎煮法（煎中药）渗漉法浸渍法（泡药酒）以水或稀醇反复提取，适于遇热易破坏或挥发性成分及含淀粉、粘液质较多的材料。（1）浸渍法民间的药酒浸制。（2）渗漉法以稀乙醇或酸、水作溶剂，先浸后渗，提取效率高于浸渍法。但溶剂用量大，对原料粒度要求高。实验室简单渗漉装置（3）煎煮法以水为溶剂，对遇热易破坏和挥发性成分有影响，对含多量淀粉、黏液质的原料也不适用。传统的中药煎制。（5）连续回流提取法循环使用挥发性的有机溶剂，在脂肪提取器中连续提取的方法。提取效率高，节省溶剂。但不适于热不稳定成分的提取。也可采用混合溶剂，常用的有水和乙醇。不同比例的溶剂可提出不同成分，如CHCl3-C2H5OH(95:5)可提取出强心甙、有机酸、叶绿素等。冷凝管脂肪提取器索式提取器的组成索式提取器连续回流提取萃取瓶（圆底烧瓶）冷凝管脂肪提取器滤纸筒虹吸管蒸汽管7、影响溶剂提取法的因素（1）生物材料的粉碎度材料细，面积大，扩散快，效果好。但是太细，吸附作用大，易糊化，扩散慢，同时植物细胞也会遭受破坏，大量蛋白质、淀粉被提出，产生沉淀或胶束状，影响提取。花、叶可适当粗些，皮、茎、根宜细些。（2）提取温度一般使用常温，在不破坏有效成分的条件下加热不要超过80˚C。温度低提取时的杂质少，温度高时提取效率高；但含淀粉、粘液质较多的材料，水提时避免热提。（3）提取时间以提完为准，是否完全可以提取也做定性实验，或薄层层析检测，或以液体颜色判断。根据检测结果确定是否需要延长提取时间。dxdc（4）浓度差根据扩散原理，造成提取液的浓度差可以提高提取的效率。可采取的措施有：搅拌、更换溶剂。（5）新技术的使用超声波、微波促提技术的应用，可以加快提取速度，提高提取效率。目前实验室广泛使用的超声波萃取仪是将超声波换能器产生的超声波通过介质（通常是水）传递并作用于样品，这是一种间接的作用方式，声振强度较低，必须通过增加超声波发生器功率（3300W）来提高萃取效率。但较大的超声波功率，又会发出令人感觉不适的噪音。超声波促提原理：为物理过程，无化学反应，不改变生物活性，高能量的超声波产生的强大压力，可造成植物细胞壁及生物体破裂，导致胞内物质释放、扩散、溶解。实验室用小型超声仪工业生产用超声仪微波辅助技术是利用样品中目标物分子在微波电磁场的作用下，从原来的热运动状态转为跟随微波交变电磁场而快速排列取向，将微波能量转化为样品内的能量，从而加速目标物从固相进入溶剂相的过程。微波促提原理：具有穿透力强，加热效率高，操作简便、快速、节能、高效等特点。缺点：化学成分的结构易发生变化，继而导致生物活性的改变。微波提取尤其要注意能量的控制，被提取物质的稳定性。工业生产用微波提取罐（二）水蒸气蒸馏法适于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的有效成分结构的提取。如挥发油、小分子生物碱、酚类、游离醌类等。水蒸气蒸馏法是将水蒸气通入不溶或难溶于水但有一定挥发性的有机物质中，使该有机物在低于100℃的温度下，随着水蒸气一起蒸馏出来。原理：道尔顿分压定律水蒸气蒸馏装置常用的水蒸气蒸馏装置，包括水蒸气发生器、蒸馏、冷凝和接受器四个部分。最常用的是二氧化碳超临界萃取法，环保、成本低、提取分离一步完成。分子的极性、沸点和分子量的大小与其在二氧化碳超临界流体中的溶解性密切相关。（三）超临界流体萃取法超临界二氧化碳流体(SFE-CO2)临界点(31.1℃)相当接近室温利用超临界条件下流体的特殊性能对样品进行提取，是20世纪80年代迅速发展起来的一种提取方法。超临界流体不但具有与液体接近的密度，有很强的穿透性，接近或超过溶剂的提取效率；而且具有与气体相近的扩散的性能，提取效率越高。常用的超临界流体有CO2、乙烷、丙烷等。与普通有机溶剂提取法相比，超临界CO2萃取技术具有无毒、常温、不易燃、无污染等特点，可确保原有的色、香、味不因受热破坏；更为可贵的是在萃取过程中可同时对萃取物进行分离纯化。该技术适宜于萃取高价值的油脂（包括天然功能性油脂）、精油、内酯等极性较低的天然产物有效成分。超临界CO2提取的特点。CO2钢瓶冷温槽高压泵恒温箱控温面板接受瓶流量计CO2原料玻璃珠脱脂棉萃取柱超临界CO2萃取实验装置示意图液体CO2由高压泵加压到萃取工艺要求的压力并传送到换热器，将CO2流体加温到萃取工艺所需温度后进入萃取器，在此完成萃取过程。负载溶质的CO2流体在分离器中改变温度压力，溶解度降低使萃取物得以分离。分离萃取物后的CO2流体再经换热器液化后回到储罐中循环使用。超临界CO2提取操作流程20世纪50年代初进入试验阶段，如从石油中脱沥青。70、80年代SFE用于食品香料的提取。90年代从植物药中提取目标成分，如从蛇床子、桑白皮、茵陈蒿中提取活性成分。ONNNNOOH3CCH3CH3（四）升华法将固体物质受热气化，遇冷又凝结为固体的方法。樟木中的樟脑，茶叶中的咖啡因的提取。2-莰酮咖啡因1、将茶叶与95%乙醇回流2h；2、滤出茶叶，浓缩提取液至适当体积；3、浓缩液与生石灰粉混合，搅成浆状，用蒸发皿在蒸汽浴上蒸干，除去水份；4、在蒸发皿上盖一张刺孔向上的滤纸，再在滤纸上罩一个大小适合且颈部塞有棉花的漏斗；5、用酒精灯隔石棉网加热，适当控制温度，白色咖啡因在滤纸上结晶。实验室提取咖啡因步骤：固体样品升华借助机械外力的作用，将油脂从榨料中挤压出来的过程。在压榨过程中，主要发生的是物理变化，如物料变形、油脂分离、摩擦发热、水分蒸发等。但由于温度、水分、微生物等的影响，同时也会产生某些生物化学方面的变化，如蛋白质变性、酶的钝化和破坏、某些物质的结合等。压榨时，榨料粒子在压力作用下内外表面相互挤紧，致使其液体部分和凝胶部分分别产生两个不同过程，即油脂从榨料空隙中被挤压出来及榨料粒子变形形成坚硬的油饼。（五）压榨法第二节天然产物的分离与精制一、一般分离方法1、萃取法2、沉淀分离法3、结晶和重结晶4、膜分离二、柱色谱法1、吸附柱色谱2、分配柱色谱3、离子交换柱色谱4、凝胶柱色谱5、大孔树脂柱色谱6、亲和柱色谱1)影响分离的因素①分离因子β，分配系数Kβ=Ka/Kb，KaKbK=CU/CLCU、CL为被分离物质在上相和下相中浓度1、萃取法利用混和物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数不同而达到分离的方法。•根据β值的大小可决定分离采用的方法β100,简单的一次萃取，可基本分离。β≈10，数次乃至10余次萃取，CCD法β≦2，100次以上萃取，DCCC法，HSCCC法β≈1，不能分离可以根据PC法计算β值，选择理想的分离条件。2.沉淀分离法•根据溶解度的不同，控制溶液条件使溶液中的化合物或离子分离的方法统称为沉淀分离法。方法的主要依据是溶度积原理。•根据沉淀剂的不同，沉淀分离也可以分成用无机沉淀剂的分离法、用有机沉淀剂的分离法和共沉淀分离富集法。沉淀分离法和共沉淀分离法的区别主要是：沉淀分离法主要使用于常量组分的分离（毫克量级以上）；而共沉淀分离法主要使用于痕量组分的分离（小于1mg/mL）。•常用的沉淀分离方法及试剂•1、无机沉淀剂氢氧化物、硫化物、其它沉淀剂。•2、有机沉淀剂草酸、铜试剂、铜铁试。3.结晶和重结晶•在化学里面，热的饱和溶液冷却后，溶质以晶体的形式析出，这一过程叫结晶。•重结晶是将晶体溶于溶剂或熔融以后，又重新从溶液或熔体中结晶的过程。重结晶可以使不纯净的物质获得纯化，或使混合在一起的盐类彼此分离。•重结晶提纯法的一般过程•1、溶剂选择•2、固体物质的溶解•3、杂质的除去•4、晶体的析出•5、晶体的收集和洗涤•6、晶体的干燥4.膜分离•利用膜的选择性分离实现料液的不同组分的分离、纯化、浓缩的过程称作膜分离①液膜分离过程分为乳化液膜和固定液膜的分离过程；②合成膜的分离过程包括微过滤、超过滤、反渗透、气体渗透分离、渗透蒸发、渗析及电渗析等过程。•二：柱色谱1.吸附柱色谱吸附分类物理吸附：无选择性吸附，吸附-解吸附发生迅速，吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭等；化学吸附：不可逆吸附，如碱性氧化铝对酚酸性成分的吸附；酸性硅胶对生物碱的吸附等；半化学吸附：聚酰胺对酚酸类、醌类的氢键吸附。吸附原理：相似相吸影响吸附过程的三要素：吸附剂（固定相）溶质（被分离物质）溶剂（洗脱剂、展开剂、流动相）•2、硅胶、氧化铝极性吸附剂：载样量大，吸附力强硅胶：有中性、酸性之分，适用于各类成分分离。氧化铝：有中性、酸性、碱性之分，不适合于分离酸性成分，多用于分离生物碱。①被分离物质吸附力与结构的关系被分离物质极性大，吸附力强，难洗脱，Rf值小。官能团极性大小排列顺序：-COOHAr-OHR-OHR-NH2、RNHR’、RNR’R’’RCONRR’RCHORCOR’RCOOR’ROR’RH②溶剂（洗脱剂）的极性与洗脱力的关系洗脱剂极性越大，洗脱力越强；OOHOHCOOHOOOHOHCH3OHOOOHOHCH3O大黄酸大黄素大黄酚酸性最强酸性其次酸性最弱溶于NaHCO3溶于Na2CO3溶于NaOH•例：从黄花夹竹桃果仁中分离到七种强心苷成分，根据极性大小推测从硅胶柱上的洗脱顺序。名称RR’黄夹苷ACHO(D-glc)2黄夹苷BCH3(D-glc)2黄夹次苷ACHOH黄夹次苷BCH3H黄夹次苷CCH2OHH黄夹次苷DCOOHH单乙酰黄夹次苷BCH3HOOOHROOR''OOR