搜索
各位老师出的习题粗略整合韩斌1.如何完成高等植物基因组的精确测序？基因组测序的方法有两种：（1）克隆步移法（BAC-by-BACstrategy）克隆步移法的步骤主要如下：首先要构建遗传图，再利用几套高度覆盖的大片段基因组文库（现在主要采用的是BAC和PAC构建文库）获得精细的物理图，选择合适的BAC或PAC克隆，再构建亚克隆库（sub-clonelibrary）进行测序，最后利用计算机对序列进行装配。要完成精确的测序，构建精细的物理图是基础。这就要求构建高覆盖率的BAC或PAC基因组文库。将全基因组DNA部分酶切，电泳选取130Kb片段，建立BAC库，然后根据酶切指纹图等方法建立物理图谱。根据BAC序列的重叠关系，将大片段的克隆在染色体上定位好，由相互关联，部分重叠的BAC克隆连成大的重叠群（contig）。Contig中的每个BAC克隆都分别用超声波破碎打断产生2~4kb的片断构建亚克隆库，使之产生10倍的测序冗余程度的亚克隆重叠群。对此亚克隆库进行测序，序列组装以完成相应BAC克隆序列。BAC内部的空洞（gap）可以利用设计引物进行PCR等手段填补。完成所有BAC克隆序列后，便可将重叠群中的BAC克隆组装起来，完成整个染色体的精细物理图。应用最新发展的高通量测序方法包括454测序技术和solexa测序技术，可大大缩短测序周期。测序的速度的较慢，要构建BAC库耗费大量的时间和资源。优点是组装的准确度较高，基因组的比较完整空隙较少。构建的克隆库可以反复使用。也可以重复。（2）全基因组鸟枪法（wholegenomeshotgunstrategy）全基因组鸟枪法测序：主要步骤是，第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基因组5倍以上。第二，高效、大规模的末端测序。对文库中每一个克隆，进行两端测序，第三，序列集合，用计算机对序列进行装配。第四，填补缺口。有两种待填补的缺口，一是没有相应模板DNA的物理缺口，二是有模板DNA但未测序的序列缺口。测序的速度较快，现在的一般都采用这种方法，不需要够大量的BAC库。缺点就是拼接的时候基因组会有很多空隙。但是如果有一个参照的标准基因组这个问题可以很好解决。2.基因组学研究的前景（下一步的主要目标）？基因组学的研究范围包括核基因组和线粒体的基因组包括结构基因组学、功能基因组学和蛋白质组学，其中主要是对DNA双螺旋序列的研究，第三代测序就是通过方法的改进使测序的长度达3Kb左右同时测序的精度也极大的提高。（1）测序技术革命加速物种基因组序列的破译。从Sanger测序法的诞生与普及到454测序法的成熟并实现了商品化，在降低成本的同时大大地提高了测序速度，更快的获得精确度更高测序的长度更长的序列，而且测序的成本也不断的降低，人们得到的测序出来的reads的长度更长可以使人们可以获得基因组上更细微的变化和跟精确图谱，例如：由于测序长度的限制一线染色体的着丝粒和两端的序列没有，而且一些高度重复序列也不知道。（2）多物种基因组水平的横向比较与进化分析。利用生物在进化上的亲缘关系，来比较不同物种之间的相似与相异，以实现基因组中功能信息的识别,它不仅能提示同属甚至同科物种基因组间的同源性和差异性，对不同物种在起源、演化过程中的变化的研究具有巨大的启示作用。（3）从单性状QTL群体分析转向基因组内多个QTL的关联分析。在植物体中，许多重要的生物性状都是由多个QTL(数量性状遗传位点)控制的，随着全基因组序列的获得及基因组注释的进一步深入，基因组内多个QTL的关联分析势在必行。（4）针对各种smallRNA及非编码序列功能的研究。目前，序列的注释和解读还十分粗浅，一些早先被认作垃圾DNA而遭忽略的成分，如miRNA、siRNA、短肽及各种转座子，陆续被证明存在有重要功能。（5）表达序列（全长cDNA）的获得。不同时空下的表达谱分析，用转录组的视角，在全基因组水平，把基因的表达与某个生命活动关联起来。除了基因序列外靶序列的甲基化状态和修饰的状态进行基因组学的的研究。也就是把影响这些因素的环境和其他因素考虑在内。（6）扩大植物基因组测序、植物相关微生物测序、植物相关宏基因组（metagenome）测序和相关高质量注释第三代测序技术测序长度据说可以达到3Kb这将极大的提高测序的精度。可以通过较低的覆盖获得非常精确的序列。这可以极大的降低测序的成本。大量的精确序列可以进行精确的比较分析可以获得基因组上微小的变化。不仅可以使比较基因组学得到发展而且可以发现更多的rareSNP。同时可以获得一些以前不知道的基因组上的重复序列等。带来的影响是非常大的1、基因组研究的最新进展（里程碑性的成果）、意义？1990人类基因组计划启动，2003年完成2000年拟南芥基因组完整图谱水稻张洪霞1.Importantosmolytes（渗透因子）thataccumulateinplantsduringdroughtandsalinityCarbohydrateNitrogenouscompoundOrganicacidSucrose（蔗糖）Proline（脯氨酸）Oxalate（草酸；草酸盐）Trehalose（海藻糖）Betaine（甜菜碱）Malate（苹果酸盐/酯）Mannitol（甘露醇）Glycine（甘氨酸）Sorbitol（山梨醇）Glutamate（甘氨酸盐/酯）Pinitol（松醇）Aspatate（天冬氨酸盐）Arabinitol（阿拉伯糖醇）Polyamines（多胺）Otherpolyols（多元醇）Proteins耐盐三标准：高盐下能生存；高盐下能完成生活史；盐土中产量和品质不受影响。植物可以分为：甜土植物（包括大部分的作物）和耐盐植物；一般以高浓度盐环境（100~200mMNaCl）能否完成生活史为判断标准。1、盐胁迫主要通过什么方式对植物造成伤害?植物通过何种方式获得耐盐性？盐胁迫的伤害主要有：初级影响：(1)渗透胁迫：盐分降低了土壤中的水势，造成植物失水，如同处在干旱中一样；(2)离子毒害，植物摄入过量钠、氯等、PH偏碱性、离子平衡被打乱后影响钠钾选择性吸收；次级影响：(1)营养紊乱：吸收矿质元素过程中盐离子与营养离子竞争，造成植物缺乏必需元素；(2)植物生长：植物受到盐胁迫时几分钟后生长速率开始下降；(3)光合下降及同化物的产量受抑制：光合磷酸化及碳同化是盐敏感的；(4)胞质代谢水平下降，能耗增加：植物逆境下生长需要额外的能量；(5)活性氧胁迫，加速衰老死亡：盐胁迫下植物的光能利用和CO2同化受抑制，促进了活性氧的生成和脂质体过氧化，对蛋白质和核酸造成损害，损伤内膜系统和酶类，加速植物衰老过程；耐盐机理：(1)渗透压调节：渗透胁迫时，细胞中有渗透活性而无毒害作用的溶质主动净增长，使得细胞水势降低。渗透调节物质包括无机离子（K）及有机小分子；(2)离子转运与平衡：盐分过多导致胞内离子紊乱，植物通过拒盐、排盐及盐的区域化等方式缓解离子胁迫。拒盐由根系的选择吸收或皮层内皮层储存，地上部分的体内循环将盐流回根内来实现；排盐就是将盐直接排到细胞外，由Na-ATP酶、Na/H反向转运蛋白来完成，也有植物通过盐腺胞吐作用排盐；区域化是指盐份大量进入液泡或叶绿体而降低胞质浓度；(3)抗氧化保护：通过酶促防御系统（SOD,APX,CAT），非酶促体系（抗坏血酸和谷胱甘肽）以及一些小分子物质清除胞内自由基；(4)渗调蛋白与LEA蛋白的作用：植物在盐胁迫下合成应激蛋白，参与抗盐；(5)其他机制：改变光合碳同化途径，即C3型转为CAM型、调节细胞分裂和生长、调控相关基因的表达、细胞解毒和修复作用等2、与盐胁迫相关的基因主要有哪几类？(1)渗透调节有关的基因：如：脯氨酸合成相关基因；甜菜碱合成相关基因，P5CS,BADH,mtlD等；(2)离子稳态平衡相关的基因：如编码液泡膜上的Na+/H+反转运蛋白的NHX1参与盐分的区域化；(3)保护酶基因：)，抗氧化保护基因：SOD（又分为不同的亚类：如Fe-SOD、Cu／Zn-SOD、Mn-SOD）,APX,CAT…)核酸代谢和修复基因(eIF1A,SRL1…)(4)耐盐相关调节基因(CBF,DREB…)和盐胁迫信号基因(CDPK,MAPK…)4.目前从植物中克隆了几类Na+/H+antiporter?它们各有什么生理功能？Na+/H+逆向运输蛋白是一类膜上的离子转运蛋白，每往一个方向上转运一个Na+的同时就往相反方向转运一个H+，维持细胞内的离子平衡。工作原理为膜上的H+-ATPase水解ATP供能，将H泵出胞外，产生跨膜质子梯度，驱动Na+/H+逆向转运蛋白，使H顺电化学梯度入胞，同时逆向排除Na，降低胞质Na+浓度，减轻Na+对酶类和膜系统的伤害，同时降低液泡渗透势，减轻细胞的渗透胁迫。①液泡膜：TonoplastNa+/H+antiporter:NHX1功能在于调节液泡pH，从而影响叶的发育以及花的颜色，维持叶片正常发育，Na+的区域化；②质膜:SOS1，SOS2，SOS3。其功能有·SOS1：将胞内多余的Na+排出胞外维持细胞质内的Na+稳态，也可以调节胞内的pH稳态，也参与到长距离的钠离子运输，通过K+运输保护质膜；鉴于SOS1有一个很长的亲水性C端在细胞质内，有人猜想二它可能还起到感应器的作用。SOS2：可自我磷酸化，能与蛋白磷酸酶2C（ABI2）发生相互作用，参与植物盐渍、干旱、冷冻胁迫中的ABA信号转到过程大的调控SOS3：受细胞内Ca+的调节，与SOS2结合，激活下游蛋白行驶功能③叶绿体膜:AtCHX23作用在于维持pH稳态和叶绿体的发育，以及耐盐。进一步研究表明叶绿体可能是潜在的Na+区域化的场所。5.植物的耐盐基因主要有哪几类？简述近年来植物耐盐基因工程的进展。植物的耐盐基因有：1渗透调节相关基因：这些基因主要参与以下物质的合成或调节:（1）氨基酸类，如脯氨酸；（2）糖醇类化合物，如甘露醇，山梨醇，海藻糖，等等；（3）季铵类化合物，如甜菜碱，胆碱，等等。例如Imtl基因全称为肌醇甲基转移酶基因，以肌醇为底物，生成一种多羟基糖醇化合物芒柄醇。芒柄醇因含有多个羟基，亲水能力强，能有效减少生理性干旱造成的损失而使植物得以耐盐；P5SC基因，在正常和胁迫条件下反馈调控植物中脯氨酸合成水平等方面均起着重要作用；gutD基因（6-磷酸山梨醇脱氢酶基因）和mtlD基因（1-磷酸甘露醇脱氢酶基因）都是从大肠杆菌中克隆的分别编码甘露醇和山梨醇的关键基因；TPS基因、otsBA基因参与海藻糖的合成；BADH基因参与甜菜合成；2功能蛋白相关基因：LEA基因表达与植物的环境胁迫成正相关。在胁迫条件下，LEA蛋白对植物细胞起保护作用，在种子成熟脱水期开始合成一系列蛋白质；dhn基因，脱水素dhn基因是一个大的基因家族，每个物种内都存在差异很大的多个基因3，信号传导相关基因：SOS基因，存在5组SOS突变体，从而鉴定了5个耐盐基因：SOS1，SOS2，SOS3，SOS4和SOS5。4，转录因子相关基因：ABA应答基因，包括基因PYL家族、PP2C、SnrKs，DREB等共同构成了干旱胁迫应答网络。5，跨膜运输蛋白，比如说质膜H+-ATPase，液泡膜H+-ATPase，Ca+-ATPase等跨膜运输蛋白。进展在p543-545。植物耐盐基因工程的进展：克隆鉴定目标基因，将目标基因转化到植物中以获得转基因工程植株，使植物育种工作取得了突破性的进展。至今植物抗盐、耐旱基因工程的研究取得了长足的进步，已有较多研究将各种抗盐基因克隆后整合入各种目标植物中，从而开辟了选育耐盐品种的新途径。转基因耐盐植物的培育：转化的基因有一下几类：兼容性渗透分子合成途径中的关键酶(P5CS,BADH,mtlD…)；离子转运蛋白(NHX1,SOS1,AVP1…)；抗氧化解毒蛋白基因(SOD,APX,CAT…)；核酸代谢及修复基因(eIF1A,SRL1…)；耐盐相关性基因的调控基因(CBF,DREB…)；盐胁迫信号转导基因(CDPK,MAPK…);盐诱导蛋