植物生理学实验论文张寿丽

干旱胁迫对小麦幼苗某些生理生化指标的影响（班级：13应生学号：134120258姓名：张寿丽）摘要：以小麦种子为实验材料，用TTC和曙红染色的方法测定小麦种子的发芽率。再以正常生长的小麦幼苗和干旱胁迫七天的小麦幼苗为实验材料，用对照的实验方法，通过紫外分光光度计测定小麦幼苗抗氧化酶（POD）活性及丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）、谷胱甘肽（GSH），H2O2的含量变化，得出干旱胁迫对上述这些生理生化指标的影响。实验结果表明：干旱胁迫下，小麦幼苗的抗氧化酶(POD)活性及丙二醛(MDA)，脯氨酸（Pro），谷胱甘肽（GSH），H2O2的含量均增加，表现出有效的抗旱效应，说明在干旱胁迫下，植物能够通过合成自身所需的以上物质来达到抗旱的作用，而且这些物可以作为植物抗旱的指标来对植物进行抗旱评价。关键词：小麦、发芽率、干旱胁迫、生理生化指标。引言：干旱是植物最易遭受的胁迫之一，每年由于干旱胁迫给农业造成的损失几乎相当于其他所有环境因子胁迫所造成的损失的总和。[1]干旱胁迫对植物的影响是一个复杂的生理生化过程，涉及到许多大分子和小分子。[2]研究表明，有理的脯氨酸在植物细胞抵抗非生物胁迫的过程中扮演着非常重要的角色，许多新的生理生化功能也逐渐被发现。干旱是一种最常见的胁迫，遇此逆境作物进行气孔调节外，渗透调节也是一种有效的方法。原理是通过加强合成代谢，增加细胞内渗透物质浓度，降低渗透势，维持膨压和细胞正常生理功能。脯氨酸作为水溶性最大的氨基酸具有较强的水合能力，是理想的渗透介质。作物遇到干旱是它的积累有助于细胞或组织持水，防止脱水，故可视为作物对干旱环境的一种适应。已经证明了在逆境条件下脯氨酸的积累来抵抗植物对非生物胁迫的伤害，植物体内的抗氧化系统也能将伤害细胞的活性氧控制在可忍耐的水平内，通过各种过氧化酶的协同作用，可以把细胞内产生的具有很强氧化性的活性氧如O2，H2O2，0H-等直接或间接的清除，防止了活性氧放大联级作用，保证了细胞内生命活动的正常进行。丙二醛是由植物衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的，对干旱也具有抵抗作用。GSH作为生物体内最主要的非蛋白巯基和含量最丰富的低分子量多肽，在植物抗逆中直接参与许许多多的功能活动。列如当细胞内生成少量H2O2是，GSH在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下，把H2O2还原成H2O，其自身被氧化为GSSG，GSSG由存在于肝脏和活细胞中的谷胱甘肽还原酶催化作用下，接受H还原成GSH,使体内自由基的清除反应能够继续持续进行。所以在干旱胁迫中由于细胞被破坏并产生有毒物质H2O2等，细胞机体就会合成H2O2等有毒物质，细胞机体就会合成大量的GSH保护自身。一、实验材料及试剂、仪器1、实验材料：50粒吸胀的小麦种子，正常生长的小麦幼苗，干旱处理过的小麦幼苗。2、实验试剂：TTC染液，曙红染液，3%磺基水杨酸（SSA），冰乙酸，茚三酮，PBS(pH=7.8)，0.6%TBA（用10%TCA配制），PBS(pH=6.8，内含1mMHA)，0.1%Ti(SO4)2[用20%(v/v)H2SO4配制]，PBS（pH=6.0,内含0.１mmol/LEDTA,1%PVP），POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解），PPO反应混合液（20mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）5%三氯乙酸，PBS(pH=7.7)，4mMDTNB(用0.1MpH=6.8PBS现配)。3、实验仪器：分光光度仪，离心机，试管，微量加样器，研钵等。二、测定项目种子的发芽率，抗氧化酶（POD）活性的测定，丙二醛（MDA）含量的测定，脯氨酸（Pro）含量的测定，H2O2的含量的测定.三、实验方法1、种子发芽率的测定：取50粒吸胀的小麦种子→沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒）其中50个半粒进行TTC染色（30℃水浴20min），另50个半粒进行曙红染色（室温染色10min）→洗净后观察。根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。2、Pro含量的测定：（1）Pro的提取：分别取0.1g实验组和对照组的幼苗→加入3mL3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL3%SSA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。（2)测定：上清液各2mL→分别加入2mL冰乙酸和2mL茚三酮试剂→煮沸15min→冷却后→5000rpm离心10min（若没沉淀可略此步骤）→分别测定A520。(3）计算：3、MDA含量的测定：（1）MDA提取：分别取0.1g实验组和对照组→加入3mL0.3%TCA和少许石英砂→充分研磨→用2mL0.3%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。（2）测定：分别取上清液各2mL→加入0.5%TBA（用10%TCA配制）2mL→煮用总显VVVWLA520Procontent=(mol.g-1FW)沸15min→冷却后→5000rpm离心5min（视沉淀有无）→分别测定OD450和OD532（3）计算：OD450=C1*85.4OD532=C1*7.4+155000*C2求解方程得：C1/（mmol/L）=11.71OD450C2/(umol/L)=6.45OD532-0.56OD450示中C1为可溶性糖的浓度；C2为MDA的浓度。4、H202含量的测定：（1）H2O2提取：分别取0.1g实验组和对照组→加入3mL0.3%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2mLTCA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。（2）测定：分别取上清液各4mL→加入0.1%Ti(SO4)2[用20%(v/v)H2SO4配制]0.2mL→摇匀→OD410(3)计算：5、抗氧化酶活性的测定：（1）抗氧化酶的提取：分别取0.1g实验材料→加入少许石英砂和3ml提取液（50mmol/LPBS,pH6.0,内含0.１mmol/LEDTA,1%PVP）→充分研磨→转入离心管中→用2ml提取液洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积→用于测定POD和PPO酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。（2）POD测定：取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解）3ml，加入酶液50ml（空白调零用提取液取代），立即记时，摇匀，读出反应0.5和1.5min时的A470。用总显VVVWLA410H2O2content=(mol.g-1FW)（3）PPO测定：取PPO反应混合液（20mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）3ml，加入酶液0.1ml（空白调零用提取液取代），立即记时，摇匀，读出反应0.5和1.5min时的A410。以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则：（4）计算：6、GSH含量的测定（1)GSH的提取：分别取0.1g实验组和对照组的幼苗→加入3mL3%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2mL3%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。（2）测定：上清液各2mL(空白用3%三氯乙酸代替)→分别加入0.4mL1MNaOH→1mL2mMDTNB→25℃5min→测定A412（3）计算：五：实验结果与分析1、小麦种子发芽率的测定实验中，TTC染色的小麦种子有45粒有生命活力，有5粒没有生命活力；曙染色的小麦种子也是有45粒有生命活力，有5粒没有生用总显VVVtWA470PODactivities=(mol.g-1FWmin-1)用总VVtWA01.0410PPOactivities=(U.g-1FW)用总显VVVWLA412GSHcontent=(mol.g-1FW)命活力。发芽率=有生命活力种子数÷种子总数=45÷50=90%表一小麦种子发芽率发芽率（%）小麦曙红染色90%TTC染色90%发芽率0%20%40%60%80%100%曙红染色TTC染色发芽率分析：由实验结果可得，小麦种子的发芽率较高，且两种染色方法的结果是一样，说明在切种子时切得较均匀。2、Pro的含量测得对照组的A520=0、443实验组的A520=3.000计算得对照组Procontent=13.72mol.g-1FW实验组Procontent=91.67mol.g-1FW表二Pro对照组和实验组的A520和ProcontentA52001234干旱胁迫正常A520Pro020406080100正常干旱胁迫Pro分析：从上表数据可得经过干旱胁迫的小麦幼苗的脯氨酸的含量大量增加，说明干旱胁迫会使脯氨酸积累。脯氨酸积累可能是生物受胁迫的一个信号。且干旱是一种最常见的胁迫，遇此逆境作物进行气孔调节外，渗透调节也是一种有效的方法。原理是通过加强合成代谢，增加细胞内渗透物质浓度，降低渗透势，维持膨压和细胞正常生理功能。脯氨酸作为水溶性最大的氨基酸具有较强的水合能力，是理想的渗透介质。作物遇到干旱是它的积累有助于细胞或组织持水，防止脱水，故可视为作物对干旱环境的一种适应。但理论上脯氨酸的增加量应正常脯氨酸含量的三倍，而我们的实验结果得出干旱胁迫是正常的六倍多，误差较大。3、MDA的含量测得对照组OD450=0.106OD532=0.077正常小麦幼苗干旱胁迫的小麦幼苗A520=0.443Procontent=13.72mol.g-1FWA520=3.000Procontent=91.67mol.g-1FW实验组OD450=2.172OD532=0.437带人以下公式:OD450=C1*85.4OD532=C1*7.4+155000*C2求解方程得：C1/（mmol/L）=11.71OD450C2/(umol/L)=6.45OD532-0.56OD450示中C1为可溶性糖的浓度；C2为MDA的浓度。得对照组MDAcontent=0.437umol/L实验组MDAcontent=1.598umol/L表三对照组和实验组的A450、A532和可溶性糖及MDA的浓度。正常小麦幼苗干旱胁迫小麦幼苗A450=0.106A450=2.172A532=0.007A532=0.437可溶性糖浓度=1.241mmol/L可溶性糖浓度=25.51mmol/LMDA浓度=0.437umol/LMDA浓度=1.598umol/LA54000.511.522.5正常干旱胁迫A540A53200.10.20.30.40.5正常干旱胁迫A532051015202530SSMDA干旱胁迫正常分析：通过实验数据可得干旱胁迫过的小麦幼苗可溶性糖浓度和MDA浓度均增加，这与前人的研究结果[3]一致。张嫂发现干旱胁迫使黄瓜幼苗MDA含量增加[4];李莉等[5]发现干旱胁迫使田间苹果梨叶片MDA含量增加。然而丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，从膜上产生的位置释放出后，与蛋白质、核酸起反应修饰其特征；使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。4、H2O2的含量测得对照组OD410=0.392实验组OD410=1.046计算得对照组H2O2content=6.1mol.g-1FW实验组H2O2content=16.27mol.g-1FW表四对照组和实验组H2O2的A410和H2O2content正常小麦幼苗干旱胁迫小麦幼苗A410=0.392A410=1.064H2O2content=6.1mol.g-1FWH2O2content=16.27mol.g-1FW05101520A410H2O2干旱胁迫正常分析：由以上实验数据可得，干旱胁迫的小麦幼苗的H2O2含量大量增加。过氧化氢是体内重要的代谢产物，其积累对细胞具有氧化破坏作用，其含量的高低，一定程度上反映了CAT活性的高低。因此，在干旱胁迫下，有可能是CAT酶活性降低，造成过氧化氢在植物体内的积累，从而破坏了细胞的氧化作用，使植物不利于在逆境中生长。5、抗氧化酶的活性实验测得对照组A410=0.024A470=0.039实验组A410=0.023A47