植物的原生质体培养.

植物的原生质体培养主要内容原生质体的概念原生质体培养的优越性原生质体的分离原生质体的培养原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露球形细胞。细胞微丝叶绿体线粒体质膜液泡细胞核内质网微管细胞壁高尔基体植物细胞模式图细胞壁由三种主要成分构成纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%一、植物原生质体的特点：1、吸收能力增强：易于摄取外来遗传物质、细胞器、细菌、病毒等；易于吸收氧、养分；2、具有全能性：具有全套的遗传物质，具有细胞壁再生并能进行人工培养分化发育成完整植株的能力；3、在一定条件下可诱导原生质体融合，形成杂种细胞。4、分泌能力提高:去除了细胞壁的扩散障碍，使细胞膜的透过性增强，利于胞内产物的分泌。5、稳定性较差:失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易于受到渗透压等条件变化的影响。原生质体用途信息传递、能量转换细胞壁合成机理膜的结构与功能核质关系杂交或自交不亲和的机理细胞间的相互作用植物激素的作用机理融合产生体细胞杂种分离各种细胞器引入各种细胞器导入外源基因诱发突变体原生质体培养的意义（1）为细胞融合奠定基础。有性杂交不能进行细胞质交流。（2）是遗传工程的理想受体。能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物。（3）理论研究。细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。因为细胞壁不仅具有保护功能，还参与细胞的生长和分化等生命活动。但是必须指出：原生质体必须再生出细胞壁才能继续发育。二、原生质体的制备不同的植物细胞，由于细胞壁的组成、结构和性质有所不同，原生质体的制备方法也不一样。1、用于分离原生质体的材料准备：选取生长旺盛的细胞，幼嫩的组织。无菌试管苗叶片上胚轴和子叶培养细胞（愈伤组织）2、原生质体的分离1）、机械法：利刃机械切割2）、酶解法：果胶酶和纤维素酶处理1）机械法1892年首先用于藻类分离原生质体做法：先使细胞质壁分离，再用刀把细胞壁切破，使原生质体流出或释放出来。优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。缺点：1)手工操作难度大，原生质体得率低，费时费力，难以大量制备。2）能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。2）酶解法1960年英国诺丁汉大学的科金第一次用酶解法从番茄幼苗根尖中大量制备出原生质体；常用酶：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶、蜗牛酶等；优点：条件温和、原生质体完整性好、活力高、得率高，而且几乎所有的植物或它们的器官组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。缺点：酶制剂中均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质，影响所获原生质体的活力。酶解制备原生质体过程1)、取材预处理2)、酶解制备3)、原生质体收集1）材料预处理(暗处理，预培养和低温处理)在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中，使细胞预质壁分离约一小时后再用酶液处理。原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度；降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率。A、酶溶剂及其渗透压酶的种类酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制、PH値。渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。B、酶解时间：酶浓度及温度。2）酶解考虑因素酶的种类和浓度•纤维素酶（Cellulase）OnozukaR-10•果胶酶（Pectolyase）Y-23•半纤维素酶（Hemicellulase）对幼叶来说，酶浓度较低：0.5％-1％纤维素酶，果胶酶(0.2％-0.5％);酶量少对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到1％或2％。酶量大酶液PH值：5.4-5.8，因为PH高，酶活性低；PH低，原生质体损坏多。酶液渗透压裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下，才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。因此在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁对原生质体起保护作用。常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地维持渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8mol/L。而蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故不常用。其它酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力酶解处理的条件光：一般黑暗下静止进行；温度：25℃，兼顾原生质体及酶活性；时间：几小时到几十小时，太长不利于原生质体的活性，一般24小时。如烟草叶片酶处理2小时后叶肉细胞解离完毕。3）原生质体分离过程：一步法（以烟草叶片为例）第一步：预处理即对烟草植株限制供水第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外表皮切成4cm的小块第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶0.5%）并加入的0.7mol甘露醇0.1mmolCaCl2.PH5.6第四步：将小块烟叶放入混合酶液25℃处理8~10小时第五步：过滤、离心、洗涤（0.7mol甘露醇液含0.1mmolCaCl2）。如此2~3次、得原生质体图示原生质体分离过程（以叶片为例）过滤、离心加果胶酶和纤维素酶以愈伤组织为材料分离原生质体。以叶片为材料分离原生质体。3、原生质体的收集和纯化：酶解处理后得到混合液包括原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养。原生质体纯化方法有：离心沉淀法，漂浮法，接口法。1）离心沉淀法筛网过滤（400目）除去未消化的细胞、细胞团和碎片后在适当试剂（甘露醇）内低速离心。优缺点：比较简单但不易除尽一些完整的细胞，或引起原生质的破碎2）飘浮法据原生质体比重小能在一定渗透压的溶液（如25%的蔗糖）中漂浮得到收集。优缺点：可以得到较为纯净、完整的原生质体。但完好的原生质体数量较少。3）沉淀法和飘浮法结合先沉淀后漂浮，重复操作，纯化后可用于培养或细胞融合。4）接口法（界面法）采用两种比重不同的溶液，使原生质体处于两液相的界面之中，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，原生质体介于两种溶液之间。优缺点：可以收到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。以柑桔为例25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液原生质体分离纯化流程图目的：检验获得的原生质体是否真正的原生质体鉴定方法(针对有无细胞壁)：4、原生质体鉴定低渗爆破法：原生质体在低渗溶液中吸水胀破，观察有无细胞壁碎片；荧光染色法：通过荧光增白剂染色后离心去除多余染料，在荧光显微镜下观察（波长3600-4400Å），绿光显示有纤维素，红光示真正的原生质体。5、原生质体活力检测染色法FDA法：FDA（二乙酸荧光素）能穿越细胞质膜，被活细胞内的酯酶裂解，在荧光显微镜下发荧光（荧光素）。伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，但质膜受到严重损坏使细胞被染色。胞质环流法：是否存在胞质环流判断原生质体活力；渗透压变化法：活原生质体会随着外界渗透压的变化体积变化。氧电极法：活原生质体在光照下光合放氧，无光呼吸耗氧。6、影响原生质体活力的因素分离材料的生理状态；酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压；分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间；环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响。二、原生质体的培养（一）培养基1．渗透压：原生质体的渗透压原则是培养基渗透压与细胞渗透压等渗。常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。2．无机盐3．有机成分：维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。4．激素：常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D5．pH值（二）原生质体培养方法液体浅层培养固体培养液体－固体双层培养琼脂糖珠培养（三）影响原生质体培养的主要因素基因型：如番茄与秘鲁番茄有性杂交后对性状分离的遗传分析，证明其愈伤组织的再生能力是2个显性基因所决定；原生质体的来源：供体材料体类型、供体细胞的分化程度、供体细胞的生长同步性；起始培养密度与培养基：基本起始密度、培养基激素水平、密度与培养基营养成分完全性。三、原生质体的发育和植株再生完整细胞植物组织原生质体植物细胞去壁植株再生？愈伤组织胚状体？？一般包括如下几个步骤：1）细胞壁再生：体积膨大，叶绿体重新排列，新的细胞壁开始合成，细胞由球形变成椭圆形。2）分裂：一般在培养2-3天后细胞质增加，细胞器增殖，DNA、蛋白质等合成增加，细胞分裂，形成小的细胞团，发育成愈伤组织或胚状体。3）植株再生第一次分裂第二次分裂第三次分裂多细胞团肉眼可见细胞团愈伤组织愈伤组织器官发生途径胚胎发生途径植株植物原生质体培养的应用1、利用原生质体融合获得融合细胞2、利用原生质体进行外源基因的转化3、利用原生质体再生植株4、利用固定化原生质体培养生产次级代谢产物较多的分泌产物5、利用原生质体进行生物转化通过原生质体中存在的酶或酶系的催化作用，将酶作用的底物转化为所需的产物，提高转化效率四、原生质体研究的趋势1、低密度和单个原生质体培养；2、单倍配子体如花粉原生质体培养；3、计算机控制系统、流式细胞光度计等技术的应用。