植物组织培养学期末复习要点

植物组织培养学期末复习要点绪论植物组织培养（Tissueculture）：是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养或试管培养。器官：根、茎、叶、花、果实、种子；组织：花药、胚珠、胚、胚乳、形成层等。或指将植物的离体器官、组织、细胞以及去除细胞壁的原生质体，放在离体无菌人工控制的环境条件下培养，对其进行克隆，使其生长、分化并成长为完整植株的过程。组织（tissue)、器官（organ)或细胞培养：指利用生物体各部分组织、器官或细胞进行离体培养，使之形成愈伤组织或完整有机体的技术。愈伤组织（callus）：在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。原生质体培养指将微生物或植物细胞游离成原生质体，在适宜培养条件下，依据细胞全能性使其再生细胞壁，并进行细胞分裂分化，形成完整个体的技术。’2）、器官发生途径：由愈伤组织或外植体诱导形成不定根或不定芽，再获得再生植株的方法。外植体→脱分化，高生长素(1,2-D)→愈伤组织→再分化低(生长素/细胞分裂素)→芽→高(生长素/细胞分裂素)→根→再生植株。外植体（explant)：由活体（invivo)植物体上切取下来的，用于组织培养的各种接种材料。包括各种器官、组织、细胞或原生质体等。按培养材料分为（Gamborg等)：①愈伤组织培养：最为常见的组织培养；②器官培养：胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养；③细胞培养：悬浮细胞培养、单细胞培养；④茎尖分生组织培养；⑤原生质体培养。根据培养器官的不同：叶培养、根培养、花药培养、胚珠培养等。根据培养方式：固体培养、液体培养。①固体培养：将培养物放在含有琼脂等固化剂的培养基表面进行培养。特点：是最常用的方法。该方法简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。②液体培养：将培养物放在未加固化剂的培养基内培养，一般需进行震荡，又称液体震荡培养。特点：于液体中氧气含量较少，常用振荡培养的方法以确保氧气的供给；往复式摇床或旋转式摇床进行培养，速度一般为50-200r／min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。根据培养物量的多少：大量培养、微量培养。根据培养过程中是否需光：光培养、暗培养。根据培养方法的不同：平板培养、微室培养、悬浮培养等。按培养过程分为：初代培养和继代培养。①初代培养：指外植体的最初培养。②继代培养：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。1904年，Hannig（胚胎学家）最先成功地培养了萝卜和辣根菜的胚。Haberlandt的观点：高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞。贡献：提出细胞全能性，首次进行离体细胞培养。1934年，美国植物生理学家White用番茄根尖建立起第一个活跃生长的无性繁殖系，从而使非胚器官的培养首先获得成功。应用领域：快速繁殖、种苗脱毒、远缘杂交、突变育种、单倍体育种、种质保存、基因工程、植物性药物和生物制品的生产。1、植物的快速繁殖：运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株，而且均来自一单一的个体，遗传性状一致。2、脱除病毒：改善作物的生长状态；生产无病毒苗木；提高产品质量与产量。由于病毒的感染严重影响作物的产量和品质，而利用组织培养技术可以有效地除去植物体内的病毒，得到大量的无病毒种苗。主要的方法是培养植物茎尖分生组织，也可以采用热处理或加入化学试剂的方法达到脱毒的效果。如马铃薯、草莓、香蕉、葡萄等等。3、培育新品种：生产符合人们需要的特性的新品种。远缘杂交：利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。4、植物种质资源的保存；5、人工种子的研究；6、次生代谢产物的生产。：鸭脚树种子愈伤组织中提取利血平用于降血压；人参根愈伤组织中提取强心配糖体治疗心脏病；红豆杉细胞中提取紫杉醇用于抗癌药物。7、基因工程：基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。第一章植物组织培养实验室及操作技术组织培养实验室布局的总体要求：便于隔离、便于操作、便于灭菌、便于观察。()实验室组成包括基本实验室(准备室、缓冲室、无菌操作室、培养室)和辅助实验室(细胞生物学实验室、温室、生化分析实验室)。基本设备：冰箱、电炉、酸度计、纯水器、天平、培养基分装器、搅拌器等。灭菌设备：蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。细胞学鉴定设备：光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜玻璃器皿：三角瓶、培养皿、培养瓶；金属材质用具：接种针、解剖刀、镊子。1、玻璃器皿洗涤：①新购置玻璃器皿：1%稀HCl浸渍12h→洗衣粉洗涤→清水冲洗→晾干备用。②已用过的玻璃器皿：洗衣粉洗涤→清水冲洗→晾干备用。2、塑料器皿洗涤：①新的塑料器皿打开即用。②已用过的塑料器皿：2%NaOH浸泡12h→清水冲洗→2%—5%盐酸浸泡30min→清水冲洗→蒸馏水冲洗→晾干备用。金属用品洗涤：热洗衣粉水洗净→冲洗→擦干。灭菌方法：①物理方法：物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等；②化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌。（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法：压力在9.8×104—10.8×104Pa，温度在121℃，灭菌20—30min；（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌，干热消毒灭菌；（3）塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌；（4）金属用具灭菌：灼烧灭菌：浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用。（5）接种室灭菌：①接种室→紫外灯照射→空气消毒灭菌；②超净工作台→紫外灯照射或70%—75%的酒精擦洗→培养材料的接种。（6）外植体灭菌：流水冲洗10—20min或更长时间—→0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右或在10%的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡30min左右—→蒸馏水冲洗4—5次—→备用。六、无菌操作：1、消毒，更换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。2、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后关闭。3、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。4、用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手。5、用沾有70%—75%酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。8、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。9、取下接种器械，在火焰上消毒。10、把培养材料放入培养瓶，盖上瓶口。11、接种结束后，清理和关闭超净工作台。注意：操作期间应经常用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。环境条件：①温度：植物材料一般最适温度在25±2℃之间；②光照：最常用的光周期是光照16h，黑暗8h；③湿度：一般情况下，培养器内相对湿度应达100%，培养室内环境的相对湿度在70%—80%；④气体：氧气是愈伤组织生长所必需的；⑤培养基的渗透压：调节渗透压常常从糖入手；⑥pH：值植物组织培养时培养基的pH值大多在5.0—6.5。植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：①组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；②构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；③元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面的作用；④发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、器官建成。Arnon和Stout（1939）提出的确定植物必需营养元素的3个标准：A、缺乏该元素，植物生育发生障碍，不能完成其生活史。B、缺乏该元素，就表现为专一的病症，且这种缺素症可以用补充改元素来预防和恢复。C、该元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改进而产生的间接效果。国内外公认的高等植物所必需的营养元素有16（17）种：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、（Ni）。根据植物体内含量多少，可把这些元素分为：①※大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上；C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种。②※微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下，有的只含0.1mg/kg，Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种。按照国际植物生理协会的建议：①所需浓度0.5mmol/L的元素为大量元素；②所需浓度0.5mmol/L的元素为微量元素。①N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。②P是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4NaH2PO4等。③K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。④Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；⑤S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。⑥Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。⑦在微量元素中，铁的使用最大：◆一些氧化酶的组成成分；◆叶绿素形成的必要条件；◆使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀。微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。3、碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。糖类物质特点：◆具有热易变的性质；◆利于吸收和利用；◆使用浓度一般在2%—5%；◆提供能源和调节渗透压。4、维生素类：◆以各种辅酶的形式存在；◆参与多种代谢活动；◆对生长，分化等有很好的促进作用；◆主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素；◆常用维生素有VB1和VB6。5、肌醇：◆环己六醇；◆细胞壁的构建材料；◆参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动；◆促进活性物质发挥作用。6、氨基酸：◆蛋白质的组成成分；◆有机氮源；◆可直接被细胞吸收利用；◆培养基中常用的是甘氨酸。3、外植体消毒：①水洗；②70%酒精浸约30—60s；③0.1%升汞浸10min或10%漂白粉上清液浸10—15min；④无菌水冲洗3—5次。4、接种：把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到无菌培养基上的过程。5、外植体培养：之把培养材料放在培养室力，使之生长，分裂或分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。⑪外植体→愈伤组织→根、芽→试管苗。①同时长芽和根；②先长芽，再长根；③先长根，再长芽。⑫外植体→胚状体→试管苗（胚状体途径）。⑬外植体→根、芽→试管苗（器官发生途径）。胚状体产生的途径：①直接从器官上发生；②从愈伤组织发生；③从游离打得单细胞发生；④从小孢子发生。诱导胚状体比诱导芽的优点：①数量多；②速度快；③结构完整。组织培养三大难题：污染、褐变、玻璃化现象。褐变：是指外植体在培养中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养基变褐色，从而抑制其他酶的活性，影响材料的培养。玻璃化现象：在长期的离体培养繁殖时，有些试管苗的嫩茎，叶片呈现半透明水渍状，这种现象称为玻璃化。第2章愈伤组织培养愈伤组织培养(callusculture):是指将外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。诱导愈伤组织的关键主要是培养条件，其中激素的成分和浓度是最重要的因素。环境条件：①光对细胞形态发生具有诱导反应；②温度有利于器官发生。不同种植物的器官组织产生的愈伤组织器官分化明显不同，差异显著：双子叶植物比单子叶及裸子植物易于发生愈伤组织；二倍体比单倍体易。个体发育年龄：①幼嫩部位易诱导形成愈伤组织，也易诱导器官分化；②愈伤组织继代次数越多，器官分化能力愈低。从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期：诱导期、分裂期、分化期。2，4-D对细胞中RNA的转录合成有促进作用常用于遇伤组织的诱导。诱导期