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第二节培养基及其配制一、培养基的成分1、无机营养（大量元素、微量元素）2、氨基酸3、有机附加物（香蕉汁、番茄汁等）4、维生素类5、糖类（蔗糖）6、琼脂7、植物生长调节物质（IAA、CTK）8、活性炭（吸附有毒有害物质）二、培养基的pH＆大多数植物要求培养基的pH为5.6~5.8＆用0.1mol/L的NaOH和0.1mol/L的HCl来调节其pH＆pH＞6.0，培养基变硬，pH＜5.0，琼脂不容易凝固三、常用培养基的种类、配方及其特点（一）培养基的种类1、根据形态，分为固体培养基、液体培养基2、根据培养过程，分为初代培养、继代培养3、根据作用，分为诱导培养基、增殖培养基、生根培养基4、根据营养水平，分为基本培养基（MS、White、B5、N6等）、完全培养基（二）几种常用培养基的配方＆注意单位：MS、White、N6、B5、Heller、Nitsh、Miller、SH等具体见P17-18（三）几种常用培养基的特点＆MS培养基：无机盐浓度高，营养丰富＆White培养基：无机盐浓度低（生根培养、胚胎培养）＆N6培养基：KNO3、（NH4）2SO4含量高，无Mo＆B5培养基：NH4+浓度低，NO3-、盐酸硫胺素含量高（适合于木本植物）＆SH培养基：与B5相似，不用（NH4）2SO4而用（NH4）H2PO4，矿质盐浓度较高＆Miller培养基：无机元素用量较MS减少1/3~1/2，微量元素种类减少，不含肌醇四、培养基的配制（一）母液的配制与保存1、母液的配制一般将母液分成大量元素、微量元素、Fe盐、维生素、氨基酸等母液；植物生长调节物质也可单独配制成母液，一般浓度为0.5~1mg/ml；2、母液的保存一般将母液保存在0~5℃的冰箱内保存（分别在母液瓶上贴上标签）。（二）培养基的配制及其灭菌1、培养基的配制方法将母液按顺序放入烧杯加入生长调节物质加琼脂加糖定容熔化琼脂调整pH培养基分装到培养瓶中加盖贴标签（注明培养基的名称与配制时间）2、培养基的灭菌条件：压力：108kPa温度：121℃时间：15~20min注意事项：1、培养基分装时，一般占试管、三角瓶等培养容器的1/5~1/3为宜，若为塑料瓶，则培养基的厚度应为1.5~2.0cm。2、分装后应立即灭菌，若不及时灭菌应保存在冰箱中，24h内完成灭菌工作。3、生长调节物质遇热不稳定，应使用过滤灭菌法，不应进行高压灭菌。4、培养基灭菌后，需在培养室内预培养3d，若无污染，证明培养基可用，最好在2周内用完，最长不超过1个月，含吲哚乙酸或赤霉素的培养基1周内使用，暂时不用的放置在10℃或4~5℃的冰箱内保存。第三节外植体的选择与培养一、外植体的选择1、选择优良的种质：材料的选择要有目的、具有一定的代表性、提高成功率、增加实用性。生长健壮、无病虫害的植株作为外植体来源。2、选择健壮的植株：选取发育正常的器官或组织，再生能力强，组培易成功。3、选择最适的时期：一般按植物生长的最适时期选取材料。4、选择合适的大小：太大容易污染，太小，多形成愈伤组织甚至难于成活，一般在0.5~1.0cm之间。补充：外植体的类型1、茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限）2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易）3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）4、花球和花蕾5、种子、根、块根、块茎、花瓣等二、外植体的灭菌＆组培成功与否的第一关键步骤。＆外植体的预处理：对外植体进行修整，去掉不要的部分，在流水下冲洗干净。＆外植体的表面灭菌：原则：充分灭菌，但不伤外植体；不同的外植体，灭菌的要求也不一样常用灭菌药剂的使用和效果消毒剂使用浓度（%）清除难易消毒时间/min灭菌效果次氯酸钠2易5-30很好次氯酸钙9-10易5-30很好漂白粉饱和溶液易5-30很好升汞0.1-1较难2-10最好酒精70-75易0.2-2好过氧化氢10-12最易5-15好溴水1-2易2-10很好硝酸银1较难5-30好抗菌素4-50mg/L中30-60较好补充：常用的灭菌方法（1）茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗—75%酒精浸泡10~20min，无菌水洗2~3次，NaClO或升汞溶液浸泡10~15min，无菌水洗3~4次；（2）果实和种子的消毒：自来水冲洗10~30min，70%酒精漂洗，2%NaClO液浸泡10min，无菌水洗2~3次，取出种子培养；（3）根及地下部器官的消毒：自来水冲洗，纯酒精漂洗，升汞浸泡5~10min或2%NaClO液浸10~15min，无菌水洗3次；（4）花药的消毒：自来水冲洗，70%酒精浸泡数秒钟，无菌水洗2~3次，漂白粉上清液浸10min，无菌水洗2~3次。消毒注意事项＆表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。＆在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。＆与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。＆若外植体污染严重则应先用流水漂洗1h以上或先用种子培养得到无菌种苗，然后用其相应部分进行组织培养。＆HgCl2效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗材料至少5次，而且要对升汞进行回收。三、外植体的接种和培养（一）外植体的接种—无菌操作＆是将表面灭菌的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，转放到无菌培养基上的全部过程。整过接种过程均需无菌操作。酒精擦拭旋转灼烧取外植体接种盖好瓶塞修剪外植体外植体接种全过程酒精擦拭手外植体消毒浸泡5min器械消毒酒精灯灼烧酒精擦拭培养皿（二）外植体的培养1、光照：每天光照12~16h，光照强度1000~5000lx（勒克斯）。2、温度：一般所用温度为25±2℃。3、湿度：要求室内的相对湿度为70%~80%4、氧气：选择通气性好的瓶盖或瓶塞（固体培养）；振荡培养可以解决通气问题（液体培养）。初代培养（Primaryculture）：指外植体的最初培养。继代培养（Subculture）：愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养物质的枯竭、水分的散失、以及一些组织代谢产物的积累，必须将初代培养得到的培养体移植于新鲜的培养基上，这种转移过程，称为继代培养。一般每隔4~6周进行一次继代培养。四、外植体的成苗途径（3种）试管苗外植体愈伤组织根、芽芽根芽根途径1（愈伤组织发生途径）：外植体经诱导后先形成愈伤组织，然后形成根和芽，再进而形成完整的植物体。途径2（胚状体发生途径）：外植体先形成胚状体（可从器官、愈伤组织、游离单细胞、小孢子发生），再发育成完整的植株。途径3（器官发生途径）：外植体经诱导后直接形成根和芽，进而形成完整的植物体，如茎尖培养。思考题：1、培养基母液如何配制与保存？2、如何选择外植体？3、横插法与竖插法的区别在哪里？4、外植体的培养条件有哪些？