植物细胞工程

2013年秋季学期细胞工程实验报告1植物细胞工程实验报告（1-3）植物愈伤组织的诱导、再分化及细胞的悬浮培养柳蕾（云南大学生命科学学院，生命科学与技术基地班，20111070021）摘要：原理和目的：根据植物细胞的全能性理论，通过脱分化、再分化等过程，通过胡萝卜愈伤组织的诱导学会通过培养基成分调控无菌操作诱导植物愈伤组织的基本技术方法，通过实验进一步深入领会植物细胞分化、脱分化、再分化的概念和过程，学习外植体的清洗、消毒、剪切和接种，无菌操作间、实验台等的消毒以及无菌操作技术等；根据胡萝卜愈伤组织经过多次继代，在细胞分裂，细胞形态和分化方面会产生各种变化，合理调节培养基中激素的种类和浓度配比，可以诱导疏松性愈伤组织的产生。利用愈伤组织获得单细胞或者小细胞团块，可以建议细胞悬浮（大量）培养的初代培养体系，并在此基础之上进行培养物的继代和保持，进行有用次生代谢物的生产的原理，学会建立胡萝卜细胞悬浮培养体系的方法和相关操作，通过胡萝卜悬浮培养生产胡萝卜素的整个过程，了解利用植物细胞悬浮（大量）培养技术生产有用次生代谢物这一个技术的主要流程，技术体系和注意事项，学会从愈伤组织诱导细胞再分化的原理和方法。关键词：愈伤组织的诱导；再分化；继代培养；悬浮培养；胡萝卜素的提取0引言植物组织培养技术是指在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体,在人工配制的环境里培养成完整的植株。植物组织培养的依据是植物细胞“全能性”及植物的“再生作用”。1902年,德国著名植物学家G.Haberlanclt根据细胞学理论,大胆地提出了高等植物的器官和组织可以不断分割,直到单个细胞,进行悬浮培养，再提取代谢物的过程，即植物体细胞在适当的条件下,具有不断分裂和繁殖,发育成完整植株的潜力的观点。1943年,美国人White在烟草愈伤组织培养中,偶然发现形成一个芽,证实了G.Haberlanclt的2013年秋季学期细胞工程实验报告2论点.。自G.Haberlandt提出的细胞全能性理论以来,在许多科学家的努力下,植物组织培养技术得到了迅速发展,其理论和方法逐渐趋于完善和成熟,并广泛应用于农业、林业、园艺、医药等行业,产生了巨大的经济效益和社会效益。1材料与方法1.1植物愈伤组织的诱导1.1.1实验仪器与用品无菌培养皿、无菌吸水纸（用饭盒包装灭菌）、镊子、解剖刀、超净工作台、恒温培养箱、干燥箱、灭菌器1.1.2实验培养基配方MS+2,4-D（1mg/L）+KT（0.5mg/L），3%蔗糖，0.9%琼脂1.1.3实验试剂0.1%的HgCl2液，10%的次氯酸钠液，75%酒精，无菌水1.1.4实验材料胡萝卜根，至少长20cm，直径3cm1.1.5实验方法1.1.5.1培养基的配制：MS+2,4-D（1mg/L）+KT（0.5mg/L），3%蔗糖，0.9%琼脂）大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素1.1.5.1.1从母液中取出（移液管）所需的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分，注意计算清楚各种物质在所须配制总体积下的加入量，将其放入小烧杯中；1.1.5.1.2在洁净的搪瓷缸里加入一定量的水（3/4）及所需要的琼脂，加热并不时搅拌，注意防止琼脂沉底焦糊；1.1.5.1.3待琼脂溶解（呈透明状，即无固体条状或丝状物，均匀而透亮）后，加入（1）中所取的各种母液及糖，并不断搅动使其混合均匀；1.1.5.1.4用1NHClorNaOH调整PH值到所须值（一般为5.8）；1.1.5.1.5加水至所须刻度；1.1.5.1.6趁热将培养基分装到培养用的容器（三角瓶等）中，注意不要把2013年秋季学期细胞工程实验报告3培养基黏附到瓶口或瓶口附近的内壁上，以免今后引起污染；1.1.5.1.7将分装好培养基的容器盖上盖子；1.1.5.1.8高压灭菌后取出，放于室温中冷却备用；1.1.5.1.9培养基及无菌用品的灭菌，121℃，30min。1.1.5.2外植体材料消毒：取6—8cm长的胡萝卜一段进行以下操作：1.1.5.2.1清洗：（流水冲洗）以下各步在超净台上进行；1.1.5.2.2将材料转入无菌烧杯或罐头瓶，加入75%酒精浸泡1—2min；1.1.5.2.3倒去酒精用0.1%升汞或10%的次氯酸钠液浸泡10—15min，不断搅拌；1.1.5.2.4倒去消毒液用无菌水洗涤3—5次；1.1.5.2.5转至吸水纸上，吸取多余水分（同一吸水纸部位不要重复使用）；1.1.5.2.6用解剖刀切去两端各0.5~1cm部分，将中断切成0.7cm厚的薄圆片；1.1.5.2.7将圆片移至无菌的部分，用刀切去外皮和中柱部分，将形成层切成1cm2的小片(图8)。1.1.5.3接种：左手拿装有培养基的罐头瓶，接近酒精灯，用右手揭去盖，将瓶外部在灯焰上燎数秒钟，并旋转使充分灼烧灭菌，右手用镊子夹取材料小片送入瓶内，平放于培养基表面，轻按一下，使其紧密接触培养基。每瓶3块，均匀分布，封好瓶口。1.1.5.4培养：放入25℃温箱中暗下培养一个月。1.2植物愈伤组织的再分化诱导1.2.1实验仪器与用品无菌培养皿、无菌吸水纸（用饭盒包装灭菌）、镊子、解剖刀、超净工作台、恒温培养箱、干燥箱、灭菌器1.2.2实验培养基配方MS+2,4-D（0.5mg/L）+KT（0.2mg/L），3%蔗糖，0.9%琼脂2013年秋季学期细胞工程实验报告41.2.3实验材料愈伤组织诱导的培养材料1.2.4实验方法1.2.4.1培养基的配制：MS+2,4-D（0.5mg/L）+KT（0.2mg/L），3%蔗糖，0.9%琼脂）大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素（配制方法与愈伤组织的诱导相同，只是有些激素或物质的量不同）1.2.4.2接种建立起来的无菌培养物无菌条件下切割分开接种在分化培养基上适当条件下（25℃温箱中光照下）培养1-3周培养反应的观察1.3植物细胞的悬浮培养以及胡萝卜素的分离提取和含量测定1.3.1实验仪器与用品无菌培养皿、无菌吸水纸（用饭盒包装灭菌）、镊子、解剖刀、超净工作台、恒温培养箱、光照、三角锥形瓶、天平、纱布/滤纸、冷凝管、蒸馏瓶、分液漏斗、表面皿、分光光度计、比色皿、移液器、移液器1.3.2实验培养基配方继代培养：MS+2,4-D（0.5mg/L）+KT（0.5mg/L），3%蔗糖,0.9%琼脂悬浮培养：MS+2,4-D（0.5mg/L）+KT（0.5mg/L），3%蔗糖1.3.3实验试剂2013年秋季学期细胞工程实验报告510%KOH的甲醇溶液、乙醚、己烷1.3.4实验材料愈伤组织诱导的培养材料1.3.5实验方法（悬浮培养体系的建立：外植体愈伤诱导愈伤继代单细胞或细胞细胞团块的获得液体培养）1.3.5.1培养基的配置（1）植物愈伤组织的继代培养：MS+2,4-D（0.5mg/L）+KT（0.5mg/L），3%蔗糖，0.9%琼脂（2）悬浮培养的培养基：MS+2,4-D（0.5mg/L）+KT（0.5mg/L），3%蔗糖1.3.5.2植物愈伤组织的继代培养将愈伤组织诱导的培养材料转移到新的培养基中，适当条件下培养，产生疏松性愈伤组织用于细胞的悬浮培养1.3.5.3植物细胞的悬浮培养1.3.5.4胡萝卜素的分离提取和含量测定1.3.5.4.1悬浮细胞的收集2013年秋季学期细胞工程实验报告61.3.5.4.2甲醇萃取β-胡萝卜素（若细胞净重大于1.2g，则加入15ml甲醇；若小于1.2g，则加入10ml甲醇）1.3.5.4.3乙醚纯化（若细胞净重大于1.2g，则加入150ml乙醚；若小于1.2g，则加入100ml乙醚）1.3.5.4.4含量的测定在波长452nm下测定吸光值A452。2实验结论2.1植物愈伤组织的诱导本实验一共做了两次2013年秋季学期细胞工程实验报告7（1）第一次做时，共接种9瓶，共2瓶水侵化，2瓶霉菌污染，1瓶细菌污染，1瓶褐变，两瓶中的两块未受污染，一块既不生长，也不死亡，也无愈伤组织的形成，另一块长出很少的愈伤组织，其余块都被细菌污染。成活率=2/8=25%污染率=3/8=37.5%1）水侵化的现象为：玻璃化现象是指在培养过程中材料呈半透明状,组织结构发育畸形（图1）；2）霉菌污染的现象为：在组织块表面长满了各种颜色的菌丝，且组织块已经不能正常生长（图2）；3）细菌污染的现象为：培养材料附近出现粘液状和发酵泡沫状物体,或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹（图3）；4）褐变的现象为：外植体组织出现变黑，变棕褐色的现象（图4）；5）长出愈伤组织的现象为：在外植体周围长出白色或淡黄色晶体（图5）。（2）第二次做时，共接种6瓶，1瓶被霉菌污染，2瓶水侵化，1瓶细菌污染，2瓶无污染（污染的情况和愈伤组织情况见上五个图）存活率=2/6=33.3%污染率=2/6=33.33%2.2植物愈伤组织的再分化诱导第一周观察接种的两瓶未出现污染，长势良好。预期结果：在三周四周甚至再过一个多月，未污染的培养基应该在组织的表面长出小苗，在经过一段时间的培养，应该会长出植株然后可移植到自然环境中进行栽培。2.3植物细胞的悬浮培养以及胡萝卜素的分离提取和含量测定（1）继代培养本小组两人共接种五瓶，四瓶被细菌污染，一瓶长出疏松型愈伤组织以下各图为被污染的情况（与愈伤组织污染现象基本相似）和完好的情况（疏松型愈伤组织可与愈伤组织诱导形成的致密型愈伤组织形成对比）2013年秋季学期细胞工程实验报告8（2）悬浮培养本组八人培养的悬浮细胞未被污染，且长势良好，培养基清亮不混浊，但培养基和细胞的总重量相对于之前有所减少。12称量前(g)168.3172.3称量后(g)168.9173细胞净重(g)0.60.7悬浮培养后(g)167.6171.7以下为悬浮培养的细胞（图7）图1外植体水侵化情况图2外植体被霉菌污染情况图3外植体被细菌污染情况图4外植体褐化情况2013年秋季学期细胞工程实验报告9图5长出的愈伤组织情况图6疏松型愈伤组织（继代培养情况）图7悬浮培养的细胞图8组织块切割示意图（3）胡萝卜素的分离提取和含量测定1）以悬浮细胞为材料测得的吸光度值含量的测定为：0.312、0.306、0.304、0.299、0、293，平均值为：0.303（细胞重量为1.5g）己烷体积为3.1ml（甲醇加入体积：20ml，乙醚加入体积为150ml）β-胡萝卜素含量=0.303/0.25/3.1ml=0.390μg/ml2）以新鲜胡萝卜为材料测得的吸光度值含量的测定为：0.937、0.920、0.906，平均值为：0.921己烷体积为3.8mlβ-胡萝卜素含量=0.3921/0.25/3.8ml=0.969μg/ml3实验分析与讨论3.1植物愈伤组织的诱导2013年秋季学期细胞工程实验报告103.1.1在培养过程中污染是经常发生的,造成污染的原因很多,如工作环境及仪器的因素、培养基及器皿灭菌不彻底、外植体带菌、操作时不遵守操作规程等,但造成污染的病原主要分为细菌和真菌两大类；3.1.2真菌性污染主要指霉菌引起的污染。真菌性污染,一般多由接种室内的空气不清洁,超净工作台的过滤装置失效,操作不慎等原因引起.此类污染可通过完善操作、培养环境、严格操作程序来克服；3.1.3出现细菌性污染，可能是因为外植体带菌或培养基灭菌不彻底,但主要是操作人员的不慎造成；3.1.4除要求操作人员严格按照无菌操作顺序操作外,对外植体带菌引起的污染,情况则比较复杂,与外植体的种类、取材季节、部位、预处理方法及消毒方法等密切相关；3.1.5要取得理想的无菌材料,以春夏生长旺季、当年生的嫩梢为佳,且取材应尽量选择晴天中午进行,或取离体枝梢在洁净空气条件下抽芽,然后从新生组织中取材接种；3.1.6外植体的彻底消毒是控制污染的前提,应根据不同材料选择合适的消毒剂和消毒方法,有些特殊材料还需进行预处理,为达到最佳消毒效果,对于材料内部带菌的组织,有时还需在培养基中加入适量抗生素，把污染完全控制在可接受的范围；3.1.7外植体会变黑色或褐色有可能是因为在接种时没等镊子等工具变凉直接切割外植体，导致外植体被烧黑，也可能是因为组织中的酚类化合物被氧化产生棕褐色