搜索
绪论：生物技术：以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理，生产生物制品和创造新物种的一种综合技术。植物细胞工程：指在植物细胞水平上进行的遗传操作。植物细胞工程就是应用植物细胞生物学和分子生物学的理论和技术，在细胞水平上离体培养或遗传操作，以达到快速繁殖、改良品种或生产更多更好的植物产品的工程学科。植物细胞工程的内容研究植物器官、组织、细胞在离体培养时需要的有机营养、无机营养、植物激素、温度、湿度、光照等环境条件以及发育阶段和基因等的遗传操作。植物细胞工程内容可分为：器官培养，胚胎培养，组织培养，原生质体培养。延伸内容：植物脱毒培养、突变体筛选、细胞杂交、超低温冷冻储藏和人工种子等。植物细胞的全能性：每个植物细胞在适合条件下具有发育成完整植物个体的潜在能力。原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因。（1）受精卵的全能性最高（2）受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。分化：细胞在形态、结构和功能上发生永久性的适度变化的过程。脱分化：有高度分化能力的组织或器官产生愈伤组织的过程。再分化：脱分化后的细胞再次分裂、分化并形成不同组织、进而构成器官和植株的过程。愈伤组织：当将离体组织或器官放在培养基上进行离体培养事，这样离体组织或器官就会进行细胞分裂，形成一种高度液泡化的呈无定形的薄壁细胞，称为愈伤组织。外植体：指用于植物培养的接种材料，包括植物体的各种器官、组织、细胞和原生质体等植物培养条件：基本培养基、适宜的植物激素、适宜的温度空气、无菌环境、适合的pH、适时光照等。胚状体:指植物细胞、组织或器官的离体培养中，起始于一个非合子细胞，并经过胚胎发育过程分化出的类似胚一样的细胞群。胚状体产生的四种方式：1.直接在器官上发生、2.培养物先形成愈伤组织，再由愈伤组织分化成胚状体、3.在花药培养中，由小孢子发育成胚状体、4.在单细胞和原生质体培养中，先由细胞行程一个胚性细胞团，再由胚性细胞团上的细胞发育成胚状体诱导胚状体途径的优点：1数量多2.速度快3.结构完整植物细胞工程的应用：1.快速繁殖2.快速繁殖实现工厂化育苗特点：繁殖快，性状稳定，整齐一致，无病虫害，周期短，周年生产。3.种苗脱毒（茎尖培养可以得到无病毒苗木）4.细胞育种(1)利用培养变异，筛选优良突变体(2)利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。4.药用植物的工厂化生产第一章：实验室设计：应选择采光好、通风好、环境干净的地点，以利于培养的顺利进行和降低培养过程的污染率。植物组织培养的实验室，通常包括通用实验室，接种室，恒温培养室，检查培养情况并做记录的细胞学实验室。对玻璃器皿要求：1.耐腐蚀；耐高温、高压2.透明度好；3.便于接种。第二章：培养基的成分：1.无机营养物（无机盐）2.碳源和能源3.维生素类4.氨基酸及有机附加物（氨基酸、维生素、肌醇、天然复合物）5.植物生长调节物质6.琼脂7.活性炭无机营养物（无机盐）：大量元素CHONPSKCAMgCl微量元素FeMnBZnMoCuCoN：蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。满足培养物对氮的需求，胚胎发生所需要的元素之一P：磷脂的主要成分，参与植物生命活动中核酸以及蛋白质合成、光合作用、呼吸作用以及能量储存、转化与释放等重要的生理过程K：对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。Mg、S、Ca：叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S：含S氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca：构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。铁：氧化酶的组成成分，又是叶绿素形成的必要条件。硼：与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系；铜：某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长；锰：与植物的光合、呼吸代谢；钼：参与氮素的代谢；氯：光合作用水光解的活化剂。VB1:促愈伤组织产生，提高活力VB6:促根生长Vpp（烟酸）:与代谢和胚发育有关Vc:防组织褐变肌醇：促进愈伤组织生长、胚状体和芽的形成，对组织细胞繁殖、分化的促进作用天然复合物：提供一些必要的微量营养成分、生理活性物质和生长激素等碳源和能源：主要是蔗糖、葡萄糖。作为离体组织赖以生长的碳源，使培养基维持一定的渗透压植物生长调节物质：1.生长素类种类：IBA—吲哚丁酸；IAA—吲哚乙酸；NAA—萘乙酸；2,4-D---2,4-二氯苯氧乙酸。作用诱导愈伤组织和根分化，促进细胞分裂和伸长。配制生长素可溶解在稀NaOH中或溶于乙醇。2.细胞分裂素类（CTK）种类：6-BA---苄氨基腺嘌呤、Kt---激动素、2-iP---异戊烯腺嘌呤、ZT-玉米素、TDZ作用：促进细胞的分裂和器官的分化，延缓组织的衰老，增强蛋白质的合成，一直顶端优势，促进侧芽的生长及显著改变其他的激素作用。生长素/细胞分裂素：高：有利于根的形成和愈伤组织的形成；适中：有利于根芽的分化；低：有利于芽的形成赤霉素：促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入。琼脂：固化作用活性炭：吸附作用，利于某些植物生根，有利于胚胎培养抗生素：抑制内生菌抗氧化物：防止氧化配制培养基母液时要用蒸馏水或重蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。药品：应选取等级较高的化学纯（CP）或分析纯(AR)母液（贮备液，stocksolution)配制的目的：1）方便配制其他培养基；2）保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取3）便于低温保藏。母可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。母液配制方法：（1）单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。（2）混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液.培养基的种类：根据其态相不同分为固体培养基和液体培养基，根据培养物的培养过程分为初代培养基和继代培养基，根据其作用不同分为诱导培养基、增殖培养基、生根培养基，根据其营养水平不同分为基本培养基和完全培养基。第三章茎尖是最好的部位：形态已基本形成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗的重要途径外植体选择的原则：1.培养材料的来源是否保证2.是否会引起不良变异。3.叶片的来源最有保证，许多植物的组织培养以叶片为外植体。4.对一些培养较困难的植物，利用子叶或下胚轴取材季节：在生长开始的季节取材，若在生长末期或已进入休眠时取样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。器官的生理状态和发育年龄：1.通常年幼组织比年老组织有较高的形态发生能力，容易培养，有较大的再生能力。2.植物上部器官的生长时间虽短，其生理年龄却较老。而越向基部，则生理年龄越小。3.上部组织容易形成花器官,下部组织越易形成营养器官。选取适宜大小：材料太大易污染；材料太小，难于成活。外植体的灭菌方法预处理：先对植物组织修整，去掉不需要的部分，流水中冲洗干净。70%的酒精中约30s，用0.1%的升汞（HgCl2）中浸泡5-10min，无菌蒸馏水冲洗3～5次污染——是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。第四章：接种：把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，并将它们转到无菌培养基上的全部操作过程。注意接种操作，防止污染，分布均匀（外植体必须与培养基紧密接触，在培养容器内均匀分布，以保证营养的充分利用，以及光照条件均匀一致），注意对象：1.种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足。2.接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形态学上端露于空气中3.接种带腋芽的茎段：将茎段平放在培养基上，可破除顶端优势，有利腋芽生长。培养方法：固体培养和液体培养。固体培养：优点:简单，应用广泛。缺点:1.外植体或愈伤组织只有底部表面接触培养基、吸收养分，造成各部分营养浓度差异，影响生长。2.外植体插入培养基后，气体交换不畅及排泄物质积累，影响组织吸收和造成毒害。3.受光不均匀，生长不一致。液体培养：分静止培养和振荡培养（连续浸没，定期浸没）静止液体培养优点：1.培养基中不出现营养物浓度差异的现象，用来进行许多营养方面的研究工作。2.静止培养不需增添专门设备，适合于某些原生质体培养；振荡液体培养：(1)连续浸没：搅动或振动培养液使组织悬浮于培养基中。培养液的体积约占容器体积的20％，以确保最大的气相表面，造成较好的通气条件。（2）定期浸没：组织块时而在液体中时而在气体里，这样既可保证培养基的充分混和，又保证了组织块呼吸所需的气体交换。外植体的培养条件：光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值、气体等褐变：是指外植体在培养过程，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之变褐而死亡的现象。褐变的原因1.褐变与外植体组织中所含的酚类化合物和多酚氧化酶有关。2.通常酚类化合物和多酚氧化酶分隔存在，比较稳定。3.当切割外植体后，切口附近的分隔作用破坏，酚类与多酚氧酶接触，酚类迅速氧化成褐色的醌类物质和水，4.醌类又会在酪氨酸酶等的作用下，与体内的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致代谢紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。防止褐变的措施：1.温度过高或光照过强，诱导多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。2.液体培养基可有效克服外植体褐变。原理：在液体培养基中，外植体溢出的有毒物质可以很快扩散，因而对外植体造成的伤害较轻。3.培养基中无机盐浓度过高，酚类物质将会大量外溢。4.黑暗条件下，生长调节物质的存在会影响褐变。细胞分裂素6-BA或KT不仅能促进酚类化合物的合成，而且还能刺激多酚氧化酶的活性。生长素类如2，4-D和IAA可延缓酚类化合物的合成，减轻褐变现象发生。5.加抗氧化剂6.加吸附剂、活性炭6.培养基的pH值较低时，可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，从而抑制褐变。外植体的玻璃化：指组培苗出现的一种生理失调或生理病变，叶、嫩梢呈水晶透明或半透明、发生异常的现象。玻璃化的危害性：由于其组织畸形，吸收养料与光合器官功能不全，分化能力大大降低，因而很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；加上生根困难，很难移栽成活。预防玻璃化的措施：1）适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度2）适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度3）适当控制培养基中无机营养成分4）增加自然光照，控制光照时间5）控制好温度6）改善培养器皿的气体交换状况7）在培养基中添加其它物质第五章：愈伤组织的形成：从外植体脱分化形成典型的愈伤组织大致可分为三个时期：起始期，分裂期，形成期。起始期：1.细胞准备进行分裂的时期。2.外植体的细胞处在静止状态。3.刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，蛋白质和核酸的合成,诱导细胞开始分裂。分裂期:外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂增生子细胞的过程。细胞的主要表现：1.外层细胞在外源激素的作用下，迅速分裂，使得外层细胞数目增加，2.细胞体积缩小，细胞的核和核仁增大到最大。逐步回到分生组织状态。3.随着细胞不断分裂和生长，细胞总干重、蛋白质和核酸量大大增加，新细胞壁合成极快。细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。形成期：指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。细胞特点：1.细胞分裂部位和方向发生改变：内部细胞发生分裂，形成像维管束或类似分生组织，组成的鸟巢状结构。2.细胞的体积相对稳定，不再减少。3.出现了各种类型的细胞：如管胞、纤维细胞、薄壁细胞、分生细胞、色素细胞等。4.生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色。愈伤组织生长周期：愈伤组织生长周期为2－4周。1.在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。2.转移到新鲜培养基：定期地将它们分成小块，接种到新鲜的培养基