当前位置:首页 > 建筑/环境 > 园林工程 > 植物脱毒和快速繁殖技术.
第七章植物脱毒和快速繁殖技术组员:贺秀娟叶研春韩婷花韩秀丽白秉元马延梅第一节植物脱毒的原理一热处理脱毒1.高温短时处理法这种方法是利用病毒与植物耐热能力的不同,将木苗、接穗或种子等繁殖材料在一定的高温下处理一段时间,将其体内的病原杀死或钝化,失去侵染能力,而保持其本身的生活力,从而达到脱毒的目的。该法尤其适用于类菌原体、类细菌的脱毒,而对于类病毒的脱毒效果较差,因为类病毒通常有较强的热稳定性。这种处理方法与1921年首先用于甘蔗的脱毒,国内用这种方法处理柑橘,可脱除柑橘材料内的黄龙病类细菌。2低热长时处理法低热长时处理一般不能使整株植株脱毒,而只能使个别器官脱毒,大多是使在热处理过程中长出的茎尖无病毒。因此,处理的最后步骤是要取新产生的茎尖嫁接到无毒实生碊木上或将新产生的茎尖进行扦插繁殖,以获得脱病毒植株。但对不同病毒及不同植物种类的脱毒率差异很大。二、组织培养脱毒1.茎尖培养脱毒Morel等(1952)首先从感染有花叶病毒的大丽花上分离出茎尖分生组织(0.25mm)培养得到植株,嫁接在大丽花实生砧木上检验未无病毒植株。从此,茎尖培养就成为脱去病毒的一个有效途径,并相继在马铃薯、菊花、兰花等茎尖培养脱毒的研究中获得成功。茎尖培养脱毒可脱除多种病毒、类病毒、类菌原体和类立克次体,很多不能通过热处理脱除的病毒可以通过茎尖培养而脱掉。茎尖培养脱毒直接从茎尖生长获得植株,很少有变异,能很好地保持品种的特性。茎尖培养之所以能脱除病毒,是因为感染病毒的植株的幼嫩及未成熟的组织和器官中病毒含量较低,生长点(约0.1~1.5mm区域)则几乎不含病毒或含病毒很少。植物茎尖等分生组织中不含或很少含有病毒的原因:(1)植物茎尖分生组织中胞间连丝发育不完全或太细,使病毒在细胞之间的扩散作用受到抑制。(2)病毒复制、运输速度与茎尖细胞生长速度不同,病毒向上运输速度慢,而而分生组织细胞繁殖快,结果使茎尖区域部分的细胞没有病毒。(3)植物生长点细胞中缺少病毒增值的感受点,因而复制过程不能进行。(4)茎尖等分生组织中存在抑制、钝化病毒的物质(5)茎尖或其他组织在培养过程中病毒被钝化或抑制2.茎尖微芽嫁接脱毒茎尖微芽嫁接脱毒是组织培养与嫁接相结合,用以获得无病毒苗木的一种新技术。他将0.1~0.3mm的茎尖作为接穗,嫁接到由试管中培养出来的无毒实生砧木上,继而进行试管培养,愈合成为完整植株的脱毒方法。它可消除用热处理不能除去的一些病毒,如衰退病毒、木质陷孔病毒、黄脉病毒等。茎尖微芽嫁接脱毒可以解决一些果树茎尖培养成苗难,特别是生根困难的问题。有些果树种类或品种,如格瑞弗斯苹果通过茎尖组织培养,可以获得无病毒新梢,但不能生根,只有通过茎尖微芽嫁接脱毒才能获得完整植株。3.其他外植体的组织培养方法脱毒除茎尖培养外,还可从花粉、花药、胚、胚珠及珠心等组织培养获得无病毒的植株。这些器官或组织也是植株中含病毒较少的部位,但不同病毒或不同寄主植物使他们带毒或不带毒的情况各不相同,采用这些器官脱毒时,首先应弄清楚其带毒情况。关于一些植物种胚中不携带病毒的原因有两种观点:一种观点认为病毒不能进入胚中,植物子房中胚与其他母体细胞之间缺少维管束组织和胞间连丝的关系;另一种是认为病毒能进入胚,但进入后为寄主所消灭。有这样一种现象,种子在未成熟时带有病毒,到成熟时,病毒就消失了,这就说明,即使没有胞间连丝,病毒还可以通过其他途径进入胚中,但是有些植物的种子中存在着一种抑制病毒的物质。此外,还有人认为是有些种胚中缺少病毒增值所需要的重要物质。而使病毒不能复制对于一些果树植物要获得与亲本一致的无性系无病材料,可以从胚囊败育的子房中在胚囊败育之前获取胚珠或珠心组织进行培养。花药或花粉培养也可以作为一种脱毒方法,这种方法可结合单倍体育种进行,用花药培养进行草莓脱毒,脱毒率可达100%。花药培养获得的无毒材料多为高产优质的类型。植物的感染病组织中不是所有细胞都含有病毒。因此,也有人从感病植株分离原生质体、愈伤细胞或其他细胞,继而培养获得植株,然后通过鉴定病毒从中选择无病的材料三、其他脱毒方法1.合并使用热处理、茎尖培养或微芽嫁接脱毒这种脱毒方法是从经热处理后的新梢顶端切取一段嫩梢,再嫁接到事先准备好的实生砧木上,如果用徒手嫁接,枝梢的长度至少要达到1.0~1.5cm方可。若要使这样长的嫩梢无病毒,对于苹果至少须热处理3~4周,而一些耐热性弱的品种,在热处理期间,因高温伤害,大部分枯死,或嫁接后成活率很低。用茎尖培养脱毒,需要用很小的茎尖才能脱除病毒,通常采用的茎尖大小为0.1~0.2mm,因茎尖太小往往成活率很低。对于茎尖嫁接也有类似情况,茎尖太小往往不能成活。因此,茎尖培养、茎尖嫁接不仅很难操作,而且一些病毒不能脱去,如单纯的茎尖嫁接不能脱除柑橘碎叶病毒。合并使用热处理、茎尖培养或茎尖嫁接能克服两种方法各自的缺点。不仅可完全脱除病毒,同时茎尖成活率也得到提高,由此可大幅度延长热处理时间,增大用于培养的茎尖长度。目前国内外葡萄、苹果的脱毒多采用热处理茎尖培养方法;柑橘则都采用热处理与茎尖嫁接相结合的办法。两种组合均提高了获得无病毒苗木的可能性2.冷处理结合茎尖培养有些作物对高温非常敏感,可用冷处理代替热处理并结合茎尖培养来脱毒。如三叶草的脱毒,将准备切去茎尖的母株在取茎尖之前,放在10℃中经过2~4个月,以代替热处理,可以部分去除病毒。这种方法也有人用于从马铃薯上消除梭状块茎类病毒。3、化学处理结合茎尖培养目前尚无一种抗病毒药剂能从整株植株消毒病毒,但某些病毒抑制剂或钝化剂加到组织培养的培养基中却能消除培养组织中的病毒。Ribavirin(抗病毒醚)是一种对DNA病毒或RNA病毒具有广谱作用的人工合成物质。Hansen等将其喷布在昆诺阿藜上,然后接种CLSV、SGV等8种病毒,结果对CLSV的增值有很强的抑制效果,但对SGV、桃坏死环斑病毒、葡萄扇叶病毒、李矮化病毒无效。在一年生苹果生长期间,每隔7天喷布1次5*10-4抗病毒醚溶液,第二年春仍从苹果苗中检出了CLSV。若在培养基中加入抗病毒醚进行苹果茎尖培养,可脱除CLSV。山家弘土用含抗病毒醚12.5、25.0的培养基培养用热处理、茎尖培养未能脱除SGV的试管苗茎尖,处理时间为40、80、120天。在各处理区增殖的新梢中任选一株,切取顶端部分长1.5,每隔40天更换1次新的培养基进行继代培养,最后继代到无药剂的培养基上培养,240天后检测病毒。40天处理的部分脱除了SGV,而80、120天两个浓度的处理均全部脱除病毒,对照则仍100%带毒。25.0对苹果茎尖有一定的要害,而12.5处理无明显药害。据分析,抗病毒醚不是直接作用于病毒,而是作用于寄主的代谢,从而阻止病毒的增殖,使新梢逐渐脱除病毒。因此,认为在果树植株生长期间定期喷布抗病毒醚,有可能在苗木顶端部分扩大无病毒区域,进而可增加茎尖培养的脱毒效率。除抗病毒醚以外,还有报道证明一些其他药剂也具有同样的作用。4、合并使用药剂合并使用化学药剂和热处理有助于提高热处理脱除病毒类病原的效果。5、培育株心苗大多数植物病毒不通过种子传播,由此可通过培育株心来获得无病毒母株。例如大多数柑橘品种产生两种完全不同的胚,即合子胚和株心胚。合子胚由受精卵细胞发育而来,常称有性胚;株心胚由母本株心体细胞发育而来,常称无性胚,株心胚在胚囊中发育,并与合子胚共存。由于株心胚是由母本体细胞发育而来,未经减数分裂,因此除个别体细胞突变外,株心胚长出的实生苗遗传上与母株完全相同。因此由株心胚获得的株心苗大多数病毒被脱除而遗传特征与母株完全相同。选择这种类型的株心苗,可应用标记花粉控制授粉,然后选出典型的实生苗。例如,枳的花粉可用作标记花粉,因为所有枳的杂种实生苗都具有三叶特征,很容易辨认和排除。培育株心系以获得无病毒苗有以下优点:(1)可以肯定植株不带毒;(2)花时间少:(3)成本低:(4)方法便于掌握:(5)株心苗长势强。但株心系童期长,且易出现一些返祖性状。第二节植物脱毒操作技术一、通过热处理消除病毒的操作技术再茎尖培养法建立以前,热疗法一直是从各种植物的受侵染的个体得到无病毒植株的有效方法。热处理可通过热水或热空气进行。热水处理对休眠芽效果较好,热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好,既能消除病毒,又能使寄主植物有较高的存活机会。热空气处理比较容易进行:把旺盛生长的植物移入到一个热疗室中,在35~40下处理一定时间即可,处理时间的长短,可由几分钟到数周不等。然而,马铃薯病毒X(PVX)则要求在35下处理几个月才能得到一些无病毒茎尖,热处理之后要立即把茎尖切下来嫁接到无病毒的砧木上去。热处理时,最初几天空气温度应逐步增高,直至达到要求的温度为止。若钝化病毒所需的连续高温处理会伤害寄主组织,则应当试验高低温交替的效果。在热处理期间应当保持适当的湿度和光照。根据Baker和Kinnaman(1973)的试验,在对香石竹进行脱毒热处理时,相对湿度必须保持在85%~95%之间,准备接受热处理的植株必须具有丰富的碳水化合物储备。为达到这个目的,事先应对植物进行回缩。Holings(1965)报道,回缩能够增加植物忍受热处理的能力。应用热疗法消除病毒的一个主要限制在于,并非所有的病毒都对热处理敏感,例如,在马铃薯应用这项技术只能消除卷叶病毒。一般来说,对于病毒等径的和线状的病毒,以及对于已知是由类菌原体引起的病害,热处理是有效的。延长寄主植物的热处理时间,也可能会钝化植物组织中的抗性因子,因而和对照相比会降低处理效果。此外,在热处理之后只有一小部分植株能够存活。与单独采用热疗法相比,茎尖培养具有更广泛的适应性。很多不能由单独的热处理消除病毒,可以通过茎尖培养和热处理相结合,或单独的茎尖培养而将其消除。二、通过茎尖培养消除病毒1、茎尖培养术语国内外用来描述茎尖培养这一技术的术语很多,在使用上也比较混乱,其中有尖芽培养、副芽培养、苗端培养、苗尖培养、分生组织培养、顶端培养等。但严格地讲,上述这些术语均不能确切地反映出用于组织培养的外植体的性质,因为仅仅依靠分生组织的生长锥、完整的顶芽或副芽,通常是不能培育出植株的。有人曾做过试验,从菊花上切取的1500个生长锥经培养,仅有3个长成完整的植株,而作者认为这3个生长锥在切取时可能带有一枚叶原基而未被发现。多数试验表明,要想获得成功,外植体就必须包括分生组织的生长锥及1至数枚叶原基,因此建议使用一个折衷的词即茎尖(或顶端)分生组织培养。在应用组织培养方法以获得无病原菌植株时,所用的外植体可以是茎尖,也可以是茎的顶端分生组织。在这里,顶端分生组织是指最幼龄叶原基上方的一部分,最大直径约为100,最长长度为250.茎尖则是由顶端分生组织及下方的1~3个幼叶原基一起构成的。虽然通过顶端分生培养基消除病毒的机会较高,但在大多数研究中,无病毒植物都是通过培养100~1000长的外植体得到的,即通过茎尖培养得到。2、方法进行脱毒时,大小合乎脱毒需要的理想的外植体实际上是太小了,很难靠肉眼进行制备,因而需要一台带有适当光源的解剖镜(8~40*)。解剖时必须注意防止由于超净台的气流和解剖镜上碘钨灯散发的热而使茎尖变干,因此茎尖暴露的时间应当越短越好。使用冷光源灯(荧光灯)或玻璃纤维灯则更为理想,若在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行解剖,也有助于防止这类小外植体变干。与其他类型的组织培养一样,在进行茎尖培养时,首先的一步是获得表面不带病原菌的外植体。一般来说,茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密保护,只要仔细解剖,无须表面消毒就应当得到无菌的外植体。如有可能,应把供试植株种在无菌的盆土中,并放在温室中进行栽培。在浇水时,水要直接浇在土壤上,而不要浇在叶片上。此外,还要给植株定期喷施内吸性杀菌剂。Wang和Hu(1980)所用的杀菌剂混合液含有杀真菌药剂苯菌灵(0.1%)和抗生素链霉素(0.1%)。使用这种杀菌剂混合液,对于田间种植的材料是格外重要的。对于某些田间植株上直接取来的枝条污染问题小得多。尽管茎尖区域是高度无菌的,在切取外植体之前一般仍须对茎尖进行表面消毒。根据Wang和Hu
本文标题:植物脱毒和快速繁殖技术.
链接地址:https://www.777doc.com/doc-2301872 .html