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1/16第一章1、植物组织培养：是指在离体条件下，利用人工培养基对植物的器官、组织、细胞、原生质体等进行培养，使其长成完整植株2、外植体：在植物组织培养中，由活体（invivo）植物上提取下来的、接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等均称为外植体。3、愈伤组织：指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。4、应用一、农业上的应用1.种苗快速繁殖(rapidpropagation)2.无病毒苗(virusfree)的培养3.在育种上的应用(breeding)（1）倍性育种，缩短育种年限，杂种优势明显；（2）克服远缘杂交的不亲合性和不孕性（胚培养）；（3）保存种质（4）创造变异二、在遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、基因工程、生物工程等方面的应用。用于基因工程技术创造植物新种质。用于植物生长发育理论研究，包括生理学、病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。三、利用组织培养材料作为植物生物反应器第二章1、细胞全能性（Totipotency）：指任何具有完整的细胞核的植物细胞都拥有形成一个完整植株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。2、细胞分化（celldifferentiation）：指导致细胞形成不同结构，引起功能或潜在的发育方式改变的过程。3、脱分化（Dedifferentiation）：指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构细胞团或愈伤组织的过程。4、再分化（Redifferentiation）：指脱分化的细胞重新恢复分化能力，形成具有特定结构和功能的细胞、组织、器官甚至植株的过程。5、植物组织培养中常遇到的问题以及解决措施一、污染及防治：1、真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉。但若是细菌污染，只要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可使用。~1/15~2、用抗生素等杀菌药剂的处理，会影响植物材料正常生长。二、褐变及防止（1）选择合适的外植体（2）合适的培养条件（3）使用抗氧化剂2/16（4）连续转移三、玻璃化问题及其防止（1）增加培养基溶质水平，降低培养基水势；（2）减少培养基含氮化合物用量；（3）增加光照；（4）增加容器通风，进行CO2施肥，对减轻试管苗玻璃化现象有明显作用；（5）降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化现象发生；（6）降低培养基细胞分裂素含量，加入适量脱落酸。四、其他问题和解决措施（一）初始培养阶段：1、培养物水浸状、变色、坏死、茎断面干枯改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间；试用其他部位，生长初期取材。2、长期培养培养物几乎无反应改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用2,4-D，调整培养温度。3、愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度。4、愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。5、侧芽不萌发，皮层过于膨大，皮孔长出愈伤组织改进措施：减少激素用量，采用较老化枝条。（二）继代培养阶段1、苗分化量少、速度慢、分枝少、个别苗细高改进措施：增加细胞分裂素，降低温度，改善光照，改单芽继代为团块（丛芽）继代。2、苗分化过多，生长慢，畸形，节间极短，苗丛密集，微型化改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。3、分化率低，畸形，培养时间长时苗再次愈伤组织化改进措施：减少生长素用量，适当降温。4、叶粗厚变脆改进措施：减少激素用量，避免叶片接触培养基。5、再生苗的叶缘、叶面等处偶有不定芽分化出来改进措施：适当减少细胞分裂素，或分阶段地利用这一再生方式。~2/15~6、丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽改进措施：减少细胞分裂素，免用赤霉素，延长光照时间，增强光照，及时转接，3/16降低接种密度。7、幼苗淡绿，部分失绿改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好PH值，调控温度、光照。8、幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中改进措施：及时转接、降低密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，控制温度。（三）生根阶段1、久不生根，基部切口无适宜愈伤组织改进措施：选用适宜的生长素或增加生长素用量，适当降低无机盐浓度。2、愈伤组织生长过快、过大，根茎部肿胀或畸形，几条根并联或愈合。改进措施：调换生长素种类或几种生长素配合使用，降低浓度，附加VB2或PG等减少愈伤等。6、操作技术一、洗涤技术1、玻璃器皿洗涤已用过的玻璃器皿2、塑料用品洗涤晾干备用3、金属用品洗涤擦干二、灭菌技术1、灭菌（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌干热消毒灭菌。（3）塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌；（4）金属用具灭菌：灼烧灭菌；浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用。（5）接种室灭菌接种室→紫外灯照射→空气消毒灭菌超净工作台→紫外灯照射、70%—75%的酒精擦洗→培养材料的接种（6）外植体灭菌流水冲洗10—20min或更长时间→70%—75%酒精中浸泡30s→0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右、在10%的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡30min左右→蒸馏水冲洗4—5次→备用第三章1、植物营养器官：植物器官培养（Organculture）是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。2、组织培养：组织培养（Tissueculture）是指对植物愈伤组织等进行离体培养4/16的技术。~3/15~3、植物器官和组织培养的基本程序一、无菌外植体的获得二、初代培养物的建立三、形态发生和植株再生四、培养产物的观察记载五、诱导生根和再生植株移栽4、形态建成方式⑴不定芽途径⑵腋芽增殖（侧芽增殖）途径⑶原球茎途径⑷胚状体途径5、根、茎、叶培养的意义1、根培养意义◆研究根系生理代谢的最优良试验体系。◆研究器官分化、形态建成的良好体系。◆建立快速生长的根无性系，对药物生产有重要意义。◆对根细胞培养物进行诱变处理，可筛选突变体，用于育种实践。2、茎培养意义✓无性系快速繁殖；✓培养无病毒苗，品种改良；✓理论基础研究。3、叶培养意义研究叶形态发生以及光合作用、叶绿素形成、遗传转化研究。第四章1、植物胚培养（EmbryoCulture）：指对植物的胚、胚乳、子房和胚珠进行离体培养，使其发育成完整植物的技术。2、胚培养的发育途径按正常胚胎发育途径形成植株脱分化形成愈伤组织胚“早熟萌发”3、胚培养的意义1、克服远缘杂交不亲和性利用“胚胎拯救（Embryorescue）”技术获得远缘杂种；2、打破种子休眠，缩短育种周期；3、提高种子萌发率；特别是对于一些长期营养繁殖植物的种子4、胚乳培养的意义5/16胚乳培养再生植株证明了全能性理论；研究胚和胚乳的关系及胚乳组织的功能；获得三倍体植株，用于育种利用。三倍体植株具有营养体大，无籽等特点。如无籽西瓜、葡萄、香蕉。胚乳培养也会产生较多的混倍体，影响育种利用。但可用于染色体工程研究。胚乳细胞是研究淀粉、蛋白质和脂类天然产物代谢途径的理想系统。5、胚“早熟萌发”：幼胚在培养基不能长出成熟胚的各种结构，越过正常胚胎发生若干阶段，直接长成幼苗。6、离体授粉（pollinationinvitro）：指将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌花粉，使之在试管内实现受精的技术。7、离体授粉的意义可以克服远缘杂交中的不亲和性，特别是离体子房授粉和离体胚珠授粉，能消除柱头和花柱所造成的受精前障碍。~4/15~8、花粉培养：是将花粉从花药中分离出来进行离体培养的过程。9、花药培养：把发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上，以改变花药内花粉粒的发育程序，诱导其分化成完整植株的过程。10、花药培养过程1.取材：多数植物以单核靠边期为宜2.灭菌及预处理未开放花蕾，常规灭菌后直接取出花药在4~5℃条件下冷处理2~4d，易产生胚状体。3.接种尽量不损伤花药并去除花丝，排除二倍体组织对单倍体植株再生的影响。4.培养常用MS、B5、Nitsch、White等培养基，3~8周后形成胚状体或愈伤。先暗培养，再转至2000lx/14h光照下促分化。11、花粉花药培养的应用1、诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期；常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。2、有利于筛选隐性突变体，提高选择效率;3、有利于隐性基因控制性状的选择；4、快速获得自交系的超雄株。第五章1、单细胞培养方法1、看护培养法2、微室培养法6/163、平板培养法2、细胞悬浮培养的意义：3、细胞培养的应用1、植物次生代谢产物的生产2、突变体选择3、诱导多变体4、原生质体培养意义1、原生质体无细胞壁，有利于细胞融合、体细胞杂交。2、原生质体容易摄取外来遗传物质，可作为理想的受体系统。5、原生质体培养方法以及融合方法原生质体培养方法：1、液体浅层培养2、固体双层培养3、固体平板培养4、琼脂糖珠培养5、双层滤纸植板培养融合法：（1）无机盐诱导融合（2）高pH—高钙离子融合（3）聚乙二醇融合法（4）电融合技术6、单倍体植物：细胞中仅含配子染色体的植物。7、细胞培养：指从体内取出组织，分离细胞，或使用细胞系，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能特性。8、超低温保存：将细胞等置于液氮中保存，解冻后仍能存活的技术。9、种质保存：指在天然或人工创造的适宜环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性的技术。~5/15~10、植物离体繁殖：指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其在短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。11、原生质体：指脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。12、原生质体融合：指不同种类的原生质体，不经过有性阶段在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。第六章1、植物离体繁殖与传统营养繁殖的优缺点7/16◆繁殖效率高，生长速度快；◆培养条件可控制性强；◆占用空间小；◆管理方便，利于自动化控制；◆便于种质交换和保存。2、快繁器官再生类型◆短枝发生型◆丛生芽发生型◆不定芽发生型◆胚状体发生型◆原球茎发生型3、快繁程序以及影响因素程序：a)无菌（或初代）培养的建立b)繁殖体增殖c)芽苗生根d)小植株的移栽驯化影响因素：◆外植体◆培养基◆培养条件◆继代培养◆移栽4、商业化生产应注意的问题污染污染来源：培养基及器具、器皿污染；外植体灭菌不彻底；操作原因；环境原因等污染控制：灭菌彻底；操作正确；保持操作区环境清洁无菌。遗传稳定性影响遗传稳定性因素：基因型；继代次数；器官发生方式。降低遗传变异措施：选用合适的基因型；减少继代次数；采用合适的器官发生方式；减少生长调节剂的使用浓度。玻璃化：发生原因：琼脂和蔗糖浓度偏低；培养温度偏高；细胞分裂素浓度偏高；乙烯的影响；光照偏弱；培养基含量偏高等因素。防止措施：提高培养基硬度；降低培养基水势；提高蔗糖含量；增加培养瓶气体交换，降低湿度；增加光照，降低温度等。褐化：8/16培养材料中酚类物质被氧化形成。影响因素：植物种类和品种（如木本比草本更易褐化）；外植体年龄和取材时间；外植体损伤程度；光温因素；培养基成分。第七章1、脱毒机理以及脱毒方法1、热处理脱毒法：原理：①热处理能钝化病毒活性，使病毒增殖减缓或停止，失去侵染能力；②同时加速植物细胞分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。~6/15~2、微体嫁接离体培养脱毒法：原理：把极小（小于0.2mm）的茎尖作为接穗接到实生砧木上（无菌种子培养获无菌苗，种子实生苗不带毒），然后将嫁接后的砧木接种到新的培养基上培养。3、微茎尖培养脱毒法：原理：①病毒在植物体内分布不均匀，越接近顶端分生组织，病毒浓度越稀。病毒DNA分子与细胞分裂蛋白质合成竞争，在迅速合成的植物细胞中正常合成的蛋白质占优势。4、珠心组织培养脱毒法：原理：病毒通过维