模拟多野三维适形.

模拟多野三维适形放疗对人HeLa细胞生物效应的研究指导教师：刘珊珊副教授研究生:刘阳前言材料与方法结果讨论结论前言由于三维适形放射治疗（3DCRT）技术具有“精确定位、精确计划设计、精确治疗”的优点，使其越来越多地被应用于临床，同时该技术也存在一些应该注意的问题，如：其质量保证（QA）和质量控制(QC)要求较常规放疗更加严格，因使用多野和众多的前言子野使其机架、治疗床、多叶光栅的运动和摆位等花费的时间较常规放疗长，这样就使得常规照射时一分次给予的剂量被分割为多次进行给予，这种情况下单位时间内肿瘤的吸收剂量就降低了,即可以看作是“相对剂量率的降低”,这种照射模式所引起的相对剂量率降低会不会对肿瘤细胞的杀灭产生影响？鉴于目前前言这方面的一些研究资料，通过模拟临床多个照射野的三维适形放射治疗中的剂量给予方式，对人宫颈鳞状上皮细胞癌HeLa细胞系进行生物效应变化的初步研究。材料与方法实验所需材料及设备如下:人宫颈鳞状上皮细胞癌HeLa细胞系由黑龙江省肿瘤医院研究所提供，培养液为RPMI1640(含10%的胎牛血清），国产塑料培养瓶（规格为30毫升），日本OLYMPUSIX70型荧光倒置显微镜，美国Forma公司电热恒温培养箱，山东新华加速器6MV高能X射线。材料与方法实验方法:一细胞培养1、细胞复苏2、传代培养3、接种细胞材料与方法二实验分组与照射方法将上述接种在不同培养瓶中的细胞分组，共分为三个组：1空白对照组：细胞不进行照射，直接放孵箱培养待测。2急速照射组：包括1、2、4、6、8、10Gy共6个照射剂量点，每个剂量点的照射完成时间为1～2min。3模拟多个材料与方法照射野的三维适形照射10min组：所含的剂量点同急速照射组。按物理师的设计要求对各个剂量点进行照射，1Gy剂量点分3次照射，间隔3～4min，2Gy和4Gy剂量点分4次照射，间隔2min，6、8、10Gy剂量点分5次照射，间隔1～2min，照射完成总的时间为10min。采用山东新华加速器6MV高材料与方法能X射线照射，剂量率为：3Gy/min。材料与方法三集落形成实验细胞照射完毕后，立即放入37℃、5%CO2孵箱内培养，定期更换培养液，约两周后，弃去培养液，用PBS冲洗两次，甲醇固定15分钟，弃掉固定液，加适量Giemsa染色20分钟，再用缓冲液小心冲洗去染色液，于荧光倒置显微镜下计数每瓶形成的克隆数(含50个材料与方法细胞以上的为一个克隆），根据成克隆实验法计算细胞存活分数，并绘制细胞存活曲线。注：细胞存活分数SF=受照射细胞的贴瓶率/对照细胞的贴瓶率对照细胞贴瓶率=克隆数/接种的细胞数材料与方法观察指标运用多靶单击数学模型拟合曲线求出Dq、Do、N等参数值。结果细胞存活曲线（cellsurvivalcurve）是用来定量描述放射吸收剂量与存活细胞数量之间关系的一种方法，是研究放射治疗肿瘤的基础。结果１不同处理条件下的细胞存活分数见表一表1不同处理组的细胞存活分数放疗剂量(Gy)存活分数急速组10min组01.0001.00010.8810.92020.6750.76140.2610.34260.0940.12580.0290.044100.0090.013结果从表中的细胞存活分数可以看出：当放射剂量不变时，延长照射时间的情况下，细胞的存活分数是较常规照射提高的。结果２不同照射模式下的HeLa细胞存活曲线如图示结果３不同照射模式下HeLa细胞的生物学参数见表二表2不同照射模式下HeLa细胞的生物学参数组别D0(Gy)Dq(Gy)NSF2急速组1.6851.6822.71340.67510min组1.8322.1363.20890.761讨论三维适形放射治疗（3DCRT）技术具有物理学上的高度精确性，逐渐成为肿瘤放射治疗领域的主流技术，但是这一新技术在生物学上存在的不足之处也值得我们进一步的研究和探索。多个照射野的设置，使其在照射实施过程中，需要分步进行，不同的照射野之间强度可能会有所不同，因此照射过程中所耗费的时间会比普通的常规放射治疗长，即常规照射时一次性给予的剂量分成了多次给予，这就形成了相对剂量率的降低。讨论急速照射是指剂量率在2Gy/min以上的照射，在多数真核细胞系统中有生物学意义的照射剂量将在数分钟内给完，在照射过程中极少发生或不发生DNA单链断裂的修复，亦看不见剂量率效应。慢速照射是指剂量率低于2×10-3Gy/min，在多数真核细胞系统中，有生物学意义的照射剂量将需要数小时才能给完，DNA单链断裂的修复大致是完全的。讨论剂量率低于2Gy/min但高于2×10-3Gy/min称为迁延性照射，在这个区域里，有生物学意义的照射剂量的给出时间和DNA单链断裂的修复速率常数差不多，可以观察到剂量率效应，表现为剂量率变化时生物效应关系也随之变化。讨论放射生物研究细胞和组织最常用的剂量率是1～5Gy/min，这也是临床外照射常用的剂量率，因此对每次2Gy的照射而言，照射时间不会超过几分钟，在这段时间里可发生由照射引起的初始化学效应（如自由基的形成），但对DNA损伤的修复或任何其他生物过程的发生是不够的。讨论但是随着剂量率的下降，给予即定剂量所需的照射时间延长，照射期间便可能发生一些生物学过程，以修饰所观察到的放射反应，这个过程可用“4Rs”来描述，即：亚致死损伤的修复（repairofsublethaldamage)、周期内细胞的再分布（redistributionwithinthecellcycle）、再群体化（repopulation）、乏氧细胞的再氧合（reoxygenation）。讨论亚致死损伤的修复这一速率一般为30分钟到数小时，计算表明，当剂量率范围从1Gy/min降低到0.1Gy/min，这个速度的修复将修饰放射所产生的生物效应。对较短时间内进行的高剂量率外照射，当照射结束时，细胞内SLD的数量应是一定的，对照射时间内的修复可以不考虑。但当单次照射时间延长至10～30分钟，可能需要对治疗时间内发生的SLD修复加以考虑。讨论Benedict等用人类胶质瘤细胞系U-87MG进行立体实验，结果显示在相同的总剂量水平下，细胞的存活分数随总治疗时间的延长而提高，例如，在12Gy水平，总治疗时间＞112min时的存活分数比16min时提高了4.7倍（0.017，0.003），在其他剂量水平也观察到相同的情况。讨论季明烁等在临床中观察到用加速器对颅内肿瘤进行立体放射治疗时，因照射中心数和旋转弧面数增加使得总治疗时间延长，生物效应可以显著降低。讨论钱立庭等模拟临床调强适形放疗的照射模式对大肠癌细胞系HT-29进行生物效应变化的研究。采用指数生长期的HT-29细胞制成单细胞悬液,于接种后12h内进行照射,分为急速照射组,15min照射组,30min照射组,各组剂量率为6Gy/min。结果显示:15、30min照射组的Dq和D0值分别增加了13.0%、11.7%和8.5%、22.0%,SF2值分别增加了22.3%、24.6%,说明随照射时间的延长,生物效应下降。讨论通过我们的试验研究，采用临床用于放疗的剂量率（3Gy/min）对人HeLa细胞进行照射，各组剂量率固定。其中10min照射组与急速照射组相比，即是把一定的剂量分多次给予，也即相当于多个子照射野的照射，使每个剂量点的照射完成时间为10min，从而使相对剂量率降低。结果表明10min照射组每个剂量点的存活分数均较急速照射组有所提高，其SF2值较急速照射组提高了12.7%。讨论与离体培养的肿瘤细胞不同，机体内的肿瘤受内环境的影响很大，如神经、体液、细胞氧合状况等多因素影响，故还应开展动物实验，进一步观察相对剂量率降低这一因素对实体肿瘤的影响。结论一多个照射野的三维适形放疗模式与单野急速照射模式相比，随分次照射时间的延长，相对剂量率的降低，细胞的生物效应下降，其SF2值提高了12.7%。二提示临床在实施适形放疗时应考虑到照射时间的延长，相对剂量率的降低这一因素，可在总剂量上予以适当补偿。致谢感谢敬爱的刘珊珊导师两年多来的悉心指导和辛勤培养感谢放疗三科全体医护人员在工作和生活上的支持与关心感谢放射物理室白彦灵和胡洪涛老师在论文完成阶段给予的帮助和指导感谢研究所的马玉颜和王波老师在实验期间给予的帮助和指导感谢放疗技术组的陈林老师在实验期间的支持感谢哈工大傅亦利教授和方涛博士在数据处理阶段给予的帮助谢谢!