武威西门塔尔牛MSTN

甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因外显子遗传变异的研究孙雪婧1a,c,高雪晋1b,李积友2,杜晓华1a,c,刘霞1b,c,杨孝朴1a(1甘肃农业大学a动物医学院b生命科学技术学院c甘肃省草食动物生物技术重点实验室2甘肃省畜牧业产业管理局)摘要：为分析肉牛MSTN基因的遗传多态性及变异特征。采用PCR-SSCP方法检测了60头甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因的多态性，对群体内各等位基因进行了克隆测序。结果显示，武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子存在A、B两个等位基因以及AA、AB两种基因型，基因型频率分别为0.9167、0.0833；第2外显子存在A、B两个等位基因以及AA、BB、AB三种基因型，基因型频率分别为0.5、0.25、0.25。序列分析表明，武威西门塔尔牛MSTN第1外显子在269bp发生了A→G的突变和第2外显子在41bp发生了C→T的突变，均属于同义突变。（结论）统计结果表明，武威西门塔尔牛MSTN基因第一外显子呈低度多态，第二外显子呈中度多态，外显子3没有发生突变。关键词：MSTN基因；遗传多态性；西门塔尔牛PolymorphisminExonsofMSTNGeneinWuweiSimmentalAbstract:(Objective)InordertostudythepolymorphismandvariationinexonsofMSTNgenein60WuweiSimmental.(Method)DNAfragmentcontainingtheexonsofMSTNgenewasamplifiedandgenotypedusingPCRsingle-strandconformationalpolymorphism(SSCP)method.RepresentativeallelesweresequencedbycloningforverificationoftheirvariationsinDNAsequences.(Result)Theresultsshowedthatthepolymorphismintheexon1wascontrolledbyAandBalleleswhichformedtwogenotypesnamelyAAandABwithfrequenciesat0.9167and0.0833respectively;thatthepolymorphismintheexon2wascontrolledbyAandBalleleswhichformedthreegenotypesnamelyAA、BBandABwithfrequenciesat0.5、0.25and0.25respectively;thatthepolymorphismintheexon3wasonlycontrolledbyAallelewhichformedonegenotypesnamelyAA.SequenceanalysisindicatedthatthereissinglenucleotidemutationincludingAtoGat269stnucleotideintheexon1andsinglenucleotidemutationincludingCtoTat41stnucleotideintheexon2,noaminoacidchange;thatthereisnonucleotidemutationintheexon3.(Conclusion)Theoverallresultsshowedthatexon1ofMSTNgenehadalowlevelofgeneticdiversityin收稿日期：基金项目：甘肃省草食畜牧业发展行动—河西肉牛选育项目（2013）作者简介：孙雪婧(1987-)，女，山东青岛人，在读硕士研究生，主要从事生物化学与分子生物学的研究。Email：[e-mail]通讯作者：杨孝朴（1962-），男，甘肃靖远县人，教授，硕士生导师，主要从事生物化学与分子生物学的研究。WuweiSimmental;thatexon2ofMSTNgenehadamiddlelevelofgeneticdiversityinWuweiSimmental.Keywords:MSTNgene;geneticpolymorphism;Simmental肌肉生成抑制素（Myostatin,MSTN）又称生长分化因子8(Growthdifferentiationfactor8,GDF-8），是转化生长因子超家族中的一员，对肌肉的分化和生长有负调控功能[1]。研究发现该基因的缺失、插入或突变会引起肌细胞增生与肌纤维肥大，从而提高产肉力，表现出“双肌”性状[2]，在肉用家畜的品种选育上有重要的作用。近几年来对MSTN基因的研究一直十分活跃，对牛、绵羊、山羊、猪、马等家畜MSTN基因的多态性都有相关的研究报道[3-5]。但有关西门塔尔牛MSTN基因的研究显见报道。甘肃省武威市为改良本地河西黄牛产肉产奶性能，从1980年开始引用乳肉兼用型西门塔尔牛冻精与本地牛进行杂交[6]，为观察其后代的遗传稳定性，本研究采用PCR-SSCP方法对60头甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因进行多态性分析，探讨武威西门塔尔牛群体MSTN基因的分子遗传特性，为武威西门塔尔牛MSTN基因的分子生物学研究及其分子育种奠定基础。1材料与方法1.1血样采集随机选取甘肃省武威市60头西门塔尔牛，每头牛颈静脉采血10mL，ACD(酸性柠檬酸葡萄糖)抗凝，-70℃冻存备用。1.2主要试剂与仪器蛋白酶K、Tris平衡酚购自大连宝生物工程有限公司；丙烯酰胺、硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）购自Amersco公司；过硫酸铵购自烟台市双双化工有限公司；去离子甲酰胺、TEMED购自sigma公司；甲叉购自上海生工生物工程股份有限公司；2×PowerTaqPCRMasterMix购自北京百泰克生物技术公司；DNAmarker购自上海捷瑞生物工程有限公司；其他常规试剂均为进口或国产分析纯级产品。梯度PCR仪为美国ABI公司生产；PROTEANⅡxiCell双垂直电泳槽、PowerpacUniversal电泳仪：美国BIO-RAD公司生产；F32加热／制冷循环仪：德国Julabo公司生产。1.3基因组DNA的提取用酚-氯仿法从血样中提取甘肃武威西门塔尔牛基因组DNA，-20℃冻存。1.4引物设计与PCR扩增参考GenBank中的牛（AC_000159）MSTN基因序列用在线设计引物软件Primer3.0设计3对引物，由北京六合华大基因有限公司合成，各引物序列见表1。表1武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子的引物序列及预扩增片段长度Table.1primerinformationforthethreeexonsofMSTNgeneinWuweisimmentalbeefcattle外显子引物预扩增片段长度外显子1上游引物（F）：5'-CCATGCAAAAACTGCAAATC-3'396bp下游引物（R）：5'-TGCACCAGCAGGACTACTCA-3'外显子2上游引物（F）：5'-CTGATCTTCTAACGCAAGTGGA-3'382bp下游引物（R）：5'-TCACTTACCAGTCCATCTTCTCC-3'外显子3上游引物（F）：5'-TTCTTTCCTTTCCATACAGACTCC-3'404bp下游引物（R）：5'-GACCTCATGAACACCCACAGCGAT-3'PCR反应体系为20μl：7.4μlddH2O，引物F和R各0.4μl，2×PowerTaqPCRMasterMix11μl，0.8μl模板，反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，外显子1、2、3的退火温度分别为57℃、56℃、58℃，退火时间为30s，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。1.5SSCP检测取2μl的PCR产物加入8μl的变性上样缓冲液（980ml/L去离子甲酰胺，0.25g/L溴酚蓝，0.25g/L二甲苯青，pH8.0、0.01mol/LEDTA），105℃变性10min，立即冰浴10min。3个片段均用100g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr：Bis的质量比为39：1），胶浓度均为14%，电压分别为150V、180V、180V，电泳时间为24h、22h。22h，温度条件分别为4℃、10℃、10℃，银染法显色后拍照。将PCR产物送于北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。1.6数据统计分析利用DNAStar软件包中的EditSeq和MegAlign程序进行DNA序列的剪切校对、比对和翻译，碱基组成一致的序列判定为同种等位基因。基因型频率、基因频率统计和χ2检验、基因杂合度(Heterozygosity,He)及有效等位基因数(Effectivenumberofalleles,Ne)检测利用POPGENE（版本1.32）软件完成，多态信息含量(Polymorphisminformationcontent,PIC)利用PIC_Calc（版本0.6）软件进行分析。2结果与分析2.1PCR扩增甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因三个外显子扩增结果经琼脂糖凝胶电泳检测，与预期扩增片段的长度相符，且条带清晰明亮无杂带，可直接用于SSCP分析（图1）。M：AccurateRun100bp-IDNAladder；1-2：外显子1产物；3-4：外显子2产物；5-6：外显子3产物M：AccurateRun100bp-IDNAladder；1-2：PCRproductsofexon1；3-4：PCRproductsofexon2；5-6：PCRproductsofexon3图1武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子的PCR扩增Fig.1PCRamplificationofthreeexonsofMSTNgeneinWuweiSimmental2.2SSCP检测SSCP分析结果显示，所检测的60头武威西门塔尔牛中发现第1外显子受A、B两个等位基因控制，存在AA、AB两种基因型；第2外显子受A、B两个等位基因控制，存在AA、BB、AB三种基因型；第3外显子只有AA一种基因型，无多态(图2)。图2A图2B图2A武威西门塔尔牛MSTN基因外显子1SSCP检测图2B武威西门塔尔牛MSTN基因外显子2SSCP检测Fig.2ADetectionofexon1ofMSTNgeneFig.2BDetectionofexon2ofMSTNgeneinWuweiSimmentalbySSCPinWuweiSimmentalbySSCP2.3序列分析对具有多态性的PCR产物进行测序，得到甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因第1外显子396bp的核苷酸序列、第2外显子382bp的核苷酸序列和第3外显子404bp的核苷酸序列。外显子1中的AB型与AA型相比，AB型的核苷酸序列在第269bp处发生A→G突变（图3），密码子由GAA变为GAG，突变前后所编码的氨基酸均为谷氨酸，为同义突变。外显子2中的AB（BB）型与AA型相比，AB（BB）型的核苷酸序列在第41bp处发生C→T突变（图4），密码子由UGC变为UGU，突变前后所编码的氨基酸均为半胱氨酸，也为同义突变；第3外显子核苷酸序列没有突变。图3外显子1AA,AB基因型位于269bp处突变的测序峰图Fig.5Themutationin269bpofexon1betweenAAandABgenotype图4外显子2AA,AB和BB基因型位于41bp处突变的测序峰图Fig.6Themutationin41bpofexon2betweenAA，ABandBBgenotype2.4遗传多态性分析对60头甘肃武威西门塔尔牛MSTN基因三个外显子的等位基因的基因型频率、基因频率进行了统计，并计算了其纯合度、杂合度和多态信息含量的值，结果见表2。表2武威西门塔尔牛MSTN基因3个外显子的等位基因频率，基因型频