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实验七-1细胞荧光染色观察与荧光显微镜的使用（示范：细胞形态观察与暗视野显微镜的使用）实验目的与教学要求1.掌握荧光显微镜的成像基本原理及其使用；2.掌握暗视野显微镜的成像基本原理及其使用。荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。一、荧光显微镜的成像原理什么是荧光?物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。保持固有的荧光特性荧光波长＞激发波长荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光的性质优点：检出能力高对细胞的刺激小能进行多重染色用途：物体构造的观察荧光的有无、色调比较进行物质判别发荧光量的测定对物质定性、定量分析荧光显微镜的优点和用途荧光素激发波长发射波长DAPI372456AMCA350450Hoechst33258365465FITC490520AcridineOrange490590AcridineYellow470550CY3552565TRITC541572PropidiumIodide530615荧光素的特性1.对细胞结构或组分的定性、定位、半定量研究。2.作为生物大分子筛选与鉴定的标记物。荧光显微镜技术在生命科学研究中的应用二、暗视野显微镜的成像原理通过特殊的暗视野聚光器，使照明光线改变途径，不直接进入物镜，而是倾斜地照射到样品上，由样品表面的绕射光线入射到物镜内，产生样品的衍射图象。三、试剂与器材青蛙、洋葱、人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片（HE染色）甲醇、1‰丫啶橙、滤纸、吸管、载玻片荧光显微镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜四、实验内容和实验步骤1.蛙血细胞染色观察：取少许蛙血→常规血涂片→凉干→甲醇固定10min→1‰丫啶橙染色5min→水洗→室温干燥（滤纸擦干玻片底面）→荧光显微镜观察（先低倍后高倍观察）（可在同一玻片上观察未荧光染色的血细胞）2.取洋葱→撕取一小片内表皮→平面单层铺展于玻片上→室温凉干→1‰丫啶橙染色5min→水洗（用吸管，小心掉片）→室温干燥（或用滤纸擦干）→荧光显微镜观察3.暗视野显微镜观察蛙血细胞（示范）4.观察人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片（HE染色）1.荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观察。2.使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛。3.暗视野显微镜要在光线尽量暗的环境下观察。五、注意事项六、作业与思考题：1.描述在荧光显微镜下所观察到的实验现象。2.绘图比较人正常肝组织细胞和脂肪肝组织细胞。实验七-2激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的应用实验目的与要求1.掌握激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理及其在生命科学中的应用。LaserScanningConfocalMicroscope1.普通荧光显微镜的不足使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61λ/NA）。但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理2.共聚焦扫描显微镜的成像原理采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。ConfocalPrinciple每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把X-Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。•观察方式：以荧光为主•光源：激光（紫外、可见光、近红外）•照明方式：点照明、逐点扫描•成像方式：共聚焦、逐点成像•输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析•多重染色样品的观察LSCM的基本特点3.共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞骨架蛋白等基因表达产物）、DNA、RNA等细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术）细胞内氧自由基活性细胞内钙离子浓度变化膜电位三、试剂与器材青蛙冷丙酮、DAPI、甘油/PBS封片剂、滤纸、吸管、载玻片、盖玻片激光扫描共聚焦显微镜四、实验步骤1.取涂有细胞的载玻片（细胞涂在中间），冷丙酮40C固定10min;2.PBS漂洗2次，每次3min;3.滴加DAPI溶液100ul室温孵育30min;4.PBS漂洗3次，每次5min;5.滴一小滴甘油/PBS封片剂(pH8.5，PBS:甘油=1:9，v/v)封片;6.激光扫描共聚焦显微镜观察。五、注意事项注意染色时间注意避光六、作业与思考题：试述激光扫描共聚焦显微镜成像基本原理，并描述实验中所观察的现象思考题：激光扫描共聚焦显微镜观察到的图象为什么比普通的荧光显微镜的清晰度、层次感要强许多？