凝胶过滤层析的基本操作

凝胶过滤层析的基本操作①凝胶介质的选择根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。对于未知蛋白，应选用分离范围较宽的凝胶，如用SephacrylS-300。对于分子量在3~5kDa的蛋白质，脱盐时应选用SephadexG50或G25；而对于小分子量多肽物质（1~5kDa），脱盐则应选用SephadexG10或SephadexG15。②凝胶介质的处理和装柱商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶胀至少24小时。溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用。凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为50~100:1。装柱时柱体要垂直，先在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）搅拌均匀，缓慢并连续地一次性注入柱内。装柱过程中，要避免柱内缓冲液流干，注意保持柱体凝胶均匀无气泡和裂缝。装完后，可用2ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的均匀性。如柱体均匀，可见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，不留任何条纹。要保持凝胶和缓冲液温度一致，以减少气泡的产生。③上样凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。样品体积不应超过柱床体积的1~5%，如超过5%，则会导致分离效率降低，低于1%则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20mg/ml。样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2，样品粘度过高，会使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。上样前样品应经0.2μm孔径滤膜过滤或10，000g离心5min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。④洗脱洗脱液应保持一定的离子强度以消除凝胶中含有的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的结合作用。Sephadex和SepharoseCL凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应为0.02mol/L；Sephacryl凝胶应为0.05mol/L。有时洗脱溶液的离子强度甚至可达0.2mol/L，以保证蛋白质不与凝胶介质结合。在凝胶过滤层析过程中，洗脱速度要恒定。流速不应过高，一般在1ml/min左右，低流速可提高分辨率。可以用恒流泵控制流速。⑤分离蛋白的监测和收集凝胶过滤层析中，分离蛋白的监测和搜集与离子交换层析相同。⑥层析柱的再生与保存洗脱完成后，继续用3-5个柱床体积缓冲液洗涤柱体，即可使凝胶再生。也可用0.2mol/LNaOH或1mol/LNaCl或非离子型去垢剂0.2~1%NP-40去除吸附过紧的杂质，再用双蒸水充分洗脱除去离子，加0.02%NaN3（抑菌剂）保存。也可在20%乙醇中保存（如SephacrylHR或SepharoseCL等）。目前常用的凝胶介质①葡聚糖凝胶（Sephadex）是以葡聚糖为基本骨架，含大量羟基，亲水性高。不溶于弱酸、碱、盐、有机溶剂及水。但在强酸中，凝胶的糖苷键易水解。如果长期与氧化剂接触，也容易被破坏。②交联丙烯基葡聚糖凝胶（Sephacryl）是由丙烯基葡聚糖与N’-亚甲基双丙烯酰胺共价交联制备的刚性凝胶。刚性极强，流速高,不溶于所有的溶剂。可在室温下，经低浓度NaOH（0.2mol\L）处理100小时，其孔径也不发生大小变化。但在低pH时,葡聚糖会发生部分降解。是一种应用较广的凝胶。③琼脂糖凝胶SepharoseCl-6B是2，3-二溴丙醇与琼脂糖在强碱条件下交联形成。其刚性好，孔径大。它的化学和物理稳定性均优于琼脂糖。可在变性剂中使用，可被消毒。适用于大分子蛋白质、DNA、RNA及病毒的分离。④SephacrylHR是丙烯基葡聚糖与双丙烯酰胺的聚合物。具有高分辨率，高稳定性和高流速的优点。分离范围从几千道尔顿到8，000，000道尔顿。这是一种新的凝胶介质。凝胶过滤层析的用途凝胶过滤层析在蛋白质分离中有以下几个方面的用途：①依据分子量大小对蛋白质进行分离；②纯化过程中的除盐，除盐速度快于透析法（常用的凝胶是葡聚糖凝胶G-25）；③分子量的测定；④检测蛋白质二聚体或寡聚体的存在。样品（其中含有大、小不同的分子）加在柱子的顶端；2.样品溶液经过层析柱，小分子通过扩散作用进入凝胶颗粒的微孔中，二大分子被排阻在颗粒之外。大小分子引向下移动速度不同而被分离开；3.随着洗脱液的洗脱，大小分子分开的距离加大；4.大分子已流出层析柱如果将凝胶作为固定相，洗脱液作为流动相，分子在柱中移动的速度取决于该分子在固定相和流动相间的分配系数Kd(distributioncoefficient)，Kd是用来表示某一分子在特定的凝胶柱内的洗脱行为。Kd是一个函数，与凝胶床的形状无关。Kd=(Ve-Vo)/Vi（2-7）式中Ve代表某一物质从层析柱内完全被洗脱下来时所需洗脱液的体积；Vo是层析柱内凝胶颗粒间空隙的总体积，也称为外水体积；Vi为层析柱内凝胶颗粒微孔的总容积，也称为内水体积。如果样品中的分子大于凝胶的孔径则先流出柱外，其Kd=0；如果样品中的分子小于凝胶的孔径则后流出柱外，其Kd=1。Kd值是在0-1之间变化。与此可见，不同溶质经过层析柱流出的顺序与其Kd值由小到大的顺序是一致的。Kd小的先流出，Kd大的后流出。