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专题2:微生物的培养与应用一、培养基作用、种类二、无菌技术三、制备牛肉膏蛋白胨培养基四、纯化大肠杆菌主要内容一、培养基人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养基质称培养基一般的培养基均需要碳源、氮源、无机盐和水等培养基的基本成分液体培养基：（一般用锥形瓶盛装）固体培养基：（一般用试管或培养皿盛装，在液体培养基的基础上再添加琼脂。）培养基的种类1、按物理状态分：2、按功能分：选择培养基：加入某种化学物质，从众多微生物中分离出所需微生物鉴别培养基：加入某种试剂，鉴别不同种类的微生物加入青霉素的培养基:不加氮源的无氮培养基:不加含碳有机物的无碳培养基:几种选择培养基举例：分离酵母菌、霉菌等真菌分离固氮菌分离自养型微生物唯一碳源为纤维素的培养基分解纤维素的细菌二、无菌技术无菌技术泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法技术。获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，无菌技术就是防止杂菌污染的操作技术。消毒1、无菌技术的种类灭菌使用较为温和的方法（酒精、紫外线）来杀死部分对人体有害的微生物。对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁消毒；将培养皿、接种用具和培养基等进行灭菌；接种的过程要在酒精灯火焰附近进行。避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品接触使用较为强烈的理化因素杀死物体内外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。（1）、灼烧灭菌：接种用具和接种过程中的试管口或瓶口放在酒精灯火焰的充分燃烧层中进行灼烧灭菌。2、常用的消毒与灭菌的方法（2）、干热灭菌：将玻璃器皿、金属用具等能耐高温并需要保持干燥的物品放到干热灭菌箱内，在160～170OC中加热1～2h即可。（3）、高压蒸汽灭菌：将需灭菌的物品放到盛有水的高压灭菌锅内煮沸，待冷空气排尽后，密闭继续加热至锅内压力到100kPa，温度到121OC后，维持15～30min即可。（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.计算：物质牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水重量5g10g5g20g定溶至1000mL2.称量准确称取各种成分，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。三、实验操作3.溶化：先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加自来水定溶至100mL。4.灭菌：将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），连同培养皿（3～5套，用几层报纸包好）一起放到高压锅内灭菌。5.倒平板：待培养基冷却到50OC左右时倒平板。倒平板操作的讨论1.培养基灭菌后要冷却到50OC时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时即可开始倒平板。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。（二）纯化大肠杆菌微生物接种方法常见的有平板划线法和稀释涂布平板法。1.平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。平板划线法获取的微生物经恒温培养后的生长情况平板划线法获取的微生物经恒温培养后的生长情况1、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环？第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后仍然要灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。平板划线法的讨论2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。2.稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。系列稀释操作101102103104105106(1)将分别盛有9mL水的试管灭菌并编号。(2)用移液管吸取1mL培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。(3)从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入第三支试管中，重复步骤2，直至到第六支试管。涂布平板操作(1)将涂布器浸在盛有70％的酒精的烧杯中。(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培养基表面。(3)将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷却8～10s。(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。稀释涂布平板法获取的菌落涂布平板操作讨论涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。将接种后和未接种（作为对照组）的培养基均放到370C的恒温箱中，培养12～24h后进行观察并记录结果。1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。2.在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似吗？如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。四、结果分析与评价3.培养12h和24h后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。4.如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。无菌操作未达到要求：可能是培养基灭菌不彻底；可能是接种时发生了污染；也可能是在培养的过程中受到了污染。1.试管低温临时保藏将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌落后，置于4OC的冰箱中保存（每隔3～6个月要重新接种培养后再保存）。2.甘油管长期保藏在3mL的甘油瓶中加入1mL的甘油，高压灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于－20OC的冷冻箱中保存。五、课题延伸---菌种的保藏