浅析植物离体快繁中常见的问1

华中农业大学学士学位论文（设计）II目录绪论………………………………………………………………………………………………………………………….11.离体快繁过程中的问题、原因及防治措施……………………………………………………………………….11.1污染问题…………………………………………………………………………………………………………….21.1.1污染的来源……………………………………………………………………………………………….22.1.2污染的防治措施………………………………………………………………………………………….21.2褐变问题……………………………………………………………………………………………………………..31.2.1褐变的原因………………………………………………………………………………………………..41.2.2克服外植体褐变的措施………………………………………………………………………………..41.3玻璃化问题………………………………………………………………………………………………………….41.3.1玻璃化发生的原因………………………………………………………………………………………41.3.2控制组培苗玻璃化的措施……………………………………………………………………………….51.4遗传稳定性………………………………………………………………………………………………………….51.4.1影响遗传稳定性的因素………………………………………………………………………………..61.4.2提高遗传稳定性，减少变异的措施………………………………………………………………..51.5黄化问题……………………………………………………………………………………………………………..51.5.1黄化原因……………………………………………………………………………………………………62.离体快繁的前景与探讨………………………………………………………………………………………………….62.2适应现状的需求………………………………………………………………………………………………………62.3存在问题………………………………………………………………………………………………………………..6参考文献………………………………………………………………………………………………………………………….6致谢…………………………………………………………………………………………………………………………………6华中农业大学学士学位论文（设计）IIII浅析植物离体快繁中常见的问题摘要植物组织培养是20世纪初发展起来的一项新技术，是现代农业生物技术的一个重要组成部分，已经日益广泛地应用于园艺植物的脱毒和快繁等方面。本文针对植物组织培养中常出现的问题进行了分析，探讨了污染、褐变、玻璃化、遗传稳定性、黄化等发生的可能原因，并提出了相应的防治措施。关键词离体快繁；污染；褐变；玻璃化；遗传稳定性；黄化AnalysisoftheCommonProblemsinPlantVitroPropagationPicktoPlanttissuecultureisdevelopedintheearly20thcentury,anewtechnologyofmodernagriculturalbiotechnology,isoneoftheimportantconstituent,hasincreasinglywidelyappliedintheenviromentofhorticulturalplantsandrapidpropagation,etc.Aimingattheplanttissuecultureoftenappearsthequestionwereanalyzed,pollution,Browning,vitrification,geneticstability,suchaspossiblereasonsBrowning,andputsforwardthecorrespondingpreventioncuoKeywordsPropagationinvitro;contamination;browning;vitrification;geneticstability;etiolation华中农业大学学士学位论文（设计）IIIIII华中农业大学学士学位论文（设计）11绪论：植物组织培养是研究植物生长和分化规律的重要手段，是在人工控制条件下培养外植体再生器官或植株的技术，可以在不受植株体其它部分干扰下研究被培养部分生长和分化的规律，并可以利用各种培养条件影响它们的发育进程。植物组织培养技术，作为现代生物技术的一个重要手段，已在很多领域得到了广泛的应用。植物离体快繁可节约人力和物力，并可人为控制培养基中的各种成分和环境条件，全年均可连续试验和生产，因而近年来在农业上的应用十分广泛。但是，在开展植物组培快繁技术研究和生产的过程中，我们发现有一些较常见的问题，有时会严重影响组培工作效率和进展，降低组培快繁的经济效益。譬如遗传稳定问题、玻璃化问题、污染及褐化问题等。因此，探讨植物离体快繁过程中常见的问题、分析其原因、提出有效的防治措施，是至关重要的。1离体快繁过程中的问题、原因及防治措施1.1污染问题1.1.1污染的来源首先应考虑无菌操作的规范性,培养基接种工具消毒是否彻底。在此基础上植物组培中的污染主要是真菌、细菌引起的污染。真菌在培养条件下生长快，很容易观察到，而细菌潜伏期长，植物组织一般不表现症状，所以很难在前期和肉眼观察到。国外有关学者认为细菌污染的来源主要有三个：一是材料内部灭菌处理不好，这样造成的污染占污染总数的1/3～1/2。二是在正常的灭菌的条件下，内生菌能够存活，这样的污染占污染源的1/4。三是来自寄生植物的污染占1/4～1/2。同时认为有些植物的昆虫和螨虫的体表带有霉菌的孢子和细菌，在九、十月份是重要的污染源，因多种植物昆虫处在大量繁殖阶段，此时大量昆虫造成的污染源最易造成组培污染的严重发生。近六年来，我们通过对猕猴桃、樱桃、托柄菝葜及大花非洲菊初级培养污染的研究中发现，高温、多雨的环境更有利于污染的发生，而且随着植物材料年龄的增长，植物材料的健康状况不断恶化，组培污染也会更加严重。另外，外植体的状况，环境条件和操作过程也是引起污染的主要原因。2.1.2污染的防治措施首先严格保证无菌操作的规范性，对培养基接种工具及接种室的严格消毒处理。然后（1）抗生素对细菌污染的防治。植物组培污染的控制取决于灭菌技术、灭菌设备、外植体年龄和环境条件等许多方面。尽管在植物组培过程中尽量使无菌条件更完善，但是污染还是经常发生，甚至有时整个实验室的组培苗部分污染或全部死亡，这是无法挽回的巨大损失，因此人们对细菌污染研究的较多。细菌污染的消除有些研究人员希望用抗生素防治，抗生素可以直接加入到培养基中，也可以用抗生素喷洒或浸泡外植体。但植物种类不同，所用抗生素的种类、浓度和处理时间也不同，还有的抗生素对污染消除根本不起作用，因此必须对不同植物采用不同的抗生素的种类、浓度和处理时间进行实验探讨。一般情况下，为消除革蓝氏阳性菌对有些木本植物污染茎段组培苗，可在培养基中加入氨中噻肟头孢菌素、四环素、利福平和多粘菌素B分别以25mg/L、25mg/L、6mg/L和6mg/L浓度的混合物，可使细菌完全被消除。另外，用头孢菌素Ⅱ和链霉素消除某些观赏植物外植体中的内生菌也有非常明显的效果。总之针对不同植物品种要想找到一种合适的抗生素处理组合是比较困难的，工作也较繁琐。国内外有关学者都认为没有一种抗生素对所有的细菌都有效，即使有效，抗生素消除植物组培污染的方法也是暂时的解决方案，如果长期使用抗生素消除污染，必然对组培苗的生长、分化和生根造成一定的影响。（2）真菌污染的防治。抗生素消除细菌的研究比较多，但目前酵母菌污染的研究相对较少，GBPoulsen等在苹果砧分裂组织微生物消除的研究中，测试了几种物质对酵母菌的毒性，虽然它们对植物材料都没有伤害，但是没有一种能够消除酵母菌。胍类化合物是对两种酵母菌有毒的唯一复合华中农业大学学士学位论文（设计）22物，但它对分裂组织有毒害作用。霉菌污染的一个重要特点是迅速，难控制。目前，关于霉菌污染的研究还很少，有人建议用防腐剂消除霉菌污染，但是还未见报到。（3）常用防治污染方法。目前外植体表面灭菌的方法除常规的氯化汞、双氧水、酒精和次氯酸钠外，用于厕所消毒的家净也是一种良好的表面杀菌剂。GRreustle等学者在对葡萄组织培养污染的研究中发现家净表面消毒效果很好，家净虽然效果极好，价格便宜，但内生菌潜伏期长，内寄生性强，危险性大，对内生菌而言，任何一种表面消毒剂对外植体的内生菌几乎都是无能为力的，除了在培养基中加入杀菌剂消除植物组培污染外，还有许多其他的方法减少污染，如用抗微生物药剂定期喷洒活植物新梢、在新梢或发芽期套袋法隔绝微生物的侵入等方法来获得外植体接种消毒成功率。另外，培养环境和接种环境的各处不同，灭菌的方法以及新型杀菌设备的应用在植物组培污染中也起着一定的重要作用。1.2褐变问题1.2.1褐变的原因褐变是材料在接种后，材料表面出现褐色物质甚至培养基也呈褐色的现象。在完整的植物体细胞中，酚类化合物与多酚氧化酶是分隔存在的，切割外植体使其受到创伤刺激，受伤细胞内的酚类化合物和多酚氧化物便流出，酚类化合物被多酚氧化物氧化成褐色的醌类物质和水。醌类物质又会和酪氨酸酶发生作用使外植体蛋白质聚合，导致外植体生长停顿，直至死亡。许多植物尤其是木本植物组织中含有较多的酚类化合物，褐变现象比较严重。影响外植体褐变的因子主要有：外植体酚类物质的含量、PPO活性上的差异、外植体的大小、培养基的成份、激素类型等。1.2.2克服外植体褐变的措施在植物组织培养中，一般都是从培养基的组成，如培养基的无机盐成份、蔗糖浓度、添加的激素的种类和浓度、加入吸附剂活性炭或PVP（聚乙烯吡咯烷酮）等来防治外植体褐化。（1）选择适当的外植体不同时期和年龄的外植体在培养中褐变的程度不同，选择适当的外植体是克服褐变重要手段。避免在夏季高温季节取材，选择幼苗、褐变程度轻的品种和部位作为外植体。（2）外植体预处理对较易发生褐变现象的外植体可采取一些措施进行预处理，即先用流水冲洗外植体，然后放置在5℃左右的冰箱中低温处理12～14h。消毒后先接种到只含蔗糖的琼脂培养基中培养3～7d，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中，取出外植体用0.1%的漂白粉溶液浸泡10min，然后再接种到合适的培养基上。（3）筛选合适的培养基和培养条件降低培养基中的盐浓度，减少BA和KT的使用，采取液体培养，初期在黑暗或弱光条件下培养，保持较低温度（15～20℃）也是降低褐变的有效方法。（4）添加抗氧化剂和系缚剂在培养基中添加抗氧化剂，或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养，可预防醌类物质的形成，对易发生褐变的植物材料培养有很好的辅助作用。常用的抗氧化剂有抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮、牛血清蛋白、硫代硫蛋白等。另外，添加1-5g/L的活性炭对酚类物质的吸附效果也很明显。（5）连续转移对易发生褐变的植物，在外植体接种后1~2d立即转移到新鲜培养基上,可减轻酚类物质对培养物的毒害作用,连续转移多次基本解决外植体的褐变问题。1.3玻璃化问题1.3.1玻璃化发生的原因（1）琼脂和蔗糖浓度与玻璃化成负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃苗的比率越低。DanielG.W.Brown认为玻璃化可能是培养基渗透势不当所致。碳源不仅为芽的形成提供能量，而且也起渗透调节作用。随琼脂浓度及纯度的增加，培养基硬度增加，从而影响其衬质势和水分状况。华中农业大学学士学位论文（设计）33（2）试管苗玻璃化可能是培养基内水分状态不适应的一种生理变态。Debergh等研究表明，液体培养基的水势影响玻璃苗的形成，Ziv等认为只要降低培养容器中的相对湿度，就可以降低玻璃苗的比例。刘思颖等（1988）测得丝石竹玻璃苗叶片的水势约为正常苗的1.9倍，含水量为正常苗的2.09-