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显微镜直接计数法一、实验目的1、明确血细胞计数板计数原理；2、掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。二、实验原理利用血细胞计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。该计数板（构造如图1所示），是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。所以无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的即共有400个小格。每一个大方格边长为1㎜，则每一大方格的面积为1㎜2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1㎜，所以计数室的容积为0.1㎜3。其计算方法如下：设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B1．16×25的计数板计算公式细胞数/ml=(A/5)×16×10000×B=32000AB个2．25×16的计数板计算公式细胞数/ml=(A/5)×25×10000×B=50000AB个三、实验器材（1）菌悬液：酵母菌悬液（2）其他物品：血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管等。四、实验步骤1．稀释：将酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。（一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜）2．镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。3．加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），使菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，静置5—10分钟即可计数。4．显微镜计数：将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。若选用25×16规格的计数板则每个计数室选5个中方格，可选4个角和中央的中格（即80个小格），若选用16×25规格的计数板，则数四个角：左上、右上、左下、右下的四个中方格，（即100小格）中的菌体进行计数。做好记录。5．清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板清洗干净，干燥后归还。五、实验原始过程记录血细胞计数板规格25×16实验现象（1）、在显微镜视野中可以清晰地看到血细胞计数板的构造，如实验原理所述一致；同时也观察到有少许污迹；（2）、在盖玻片边缘滴一小滴菌悬液后，菌悬液迅速充满计数室，无气饱；（3）、视野中清晰地看见有密密麻麻的白色小颗粒（形如鱼卵）、且有部分细胞正处于出芽生殖阶段，有的明显形成芽体。（4）、逐渐稀释后，细胞在一侧变得十分密集，而另一侧比没稀释前稀疏许多，能够数出计数室内最小方格内的细胞数，各中格子中菌数如表1：表1：各中格中菌数记录与处理表A表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数。六、结果与分析（一）、实验结论与分析1、1ml酵母菌悬液中约有57350000个酵母细胞；2、微生物的个体之小；3、酵母主要以出芽生殖方式进行增殖，繁殖力强。本实验经血细胞计数板计数得到1ml酵母菌悬液中酵母细胞个数只能是一个概数。原因有许多，就计数板就存在着固有误差，不可避免；加之实验者在相对狭窄的显微镜视野中进行计数及所用的计数规则因人而异，误差更大。误差来源及如何提高实验准确性详见注意事项与思考题回答。（二）、注意事项：1、加样切勿贪多，一般滴一滴即可（最多两滴），且计数室内不能产生气泡。2、计数时，位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。3、应在水龙头下用水柱冲洗清洗血球计数板，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。（三）、思考题1、据你体会，说明血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？答：A、系统误差：Ⅰ、仪器不够准确与精密：如计数板磨损致使刻度不均匀，显微镜镜头磨损等Ⅱ、细胞分布不均匀计数室各中格中菌数AB菌数/ml二室平均值12345第一室9250761108341124110000057350000第二室6844849676368473600000菌数/ml=(A/5)×25×10000×B=50000AB个B、偶然误差：操作人员器材处理、使用不当，稀释不准确，细胞识别错误：如盖玻片、吸管、计数板等不洁净；显微镜视野不明亮等C、措施系统误差可通过规范操作、提高熟练程度和校正仪器而避免或纠正，但细胞分布误差却难于彻底消除。如下措施可以减少偶然误差：（1）所用器材均应清洁干燥，计数板、盖玻片等的规格应符合要求或经过校正。（2）所配制的酵母菌悬液浓度合适且便于稀释，做到等渗、新鲜、无杂质微粒。（3）菌悬液要滴加适量，稀释倍数不宜太大，一般样稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。（4）严格操作，在加上盖玻片后滴加菌悬液使其充满计数室，且须一次性充满，防止产生气泡，充入细胞菌液的量以不超过计数室台面与盖玻片之间的矩形边缘为宜。（5）一定要调好显微镜，使能够清晰地观察到计数室的最小方格的刻线等。（6）其他如同注意事项。