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易错PCR技术应用于酶体外进化的研究进展沈思军1*，马春萍2，哈杰提2，马全磊1(1.石河子大学动物科技学院，新疆，石河子，832003；2.新疆西部牧业股份有限公司，新疆，石河子，832000)摘要：易错PCR技术是通过调整PCR反应条件，产生随机错配而引入多个突变。由于该技术操作简单易行，广泛应用于酶工程改造研究中。本文介绍了易错PCR技术的影响因素及近几年在酶工程改造中的应用进展。关键词：易错PCR技术；影响因素；酶工程改造在体外进行酶分子改造的常用采用分子体外定向进化技术。常用的方法有易错PCR（error-pronePCR）、DNA重排（DNAshuffling）、交错延伸法（staggeredextensionprocess,StEP）、随机引物体外重组（random-priminginvitrorecombination,RPR）、易错滚环扩增法（error-pronerollingcircleamplification,EP-RCA）、序列饱和诱变（sequencesaturationmutagenesis,SeSaM）、随机插入/删除的链交换突变（randominsertion/deletionstrandexchangemutagenesis,RAISE）等[1]。基本原理都是通过导入突变获得大量含有不同突变的酶，在不同环境条件下定向筛选有益突变菌株。易错PCR是通过改变PCR条件，提高扩增产物的三大错配率，从而获得与原来不同的DNA序列或基因[2]，其操作简便易行，成为体外酶工程应用较为广泛的技术之一。本文就易错PCR过程中影响突变率的因素和易错PCR技术在酶分子进化中的应用这两个方面，综述国内近几年的研究进展。1.影响易错PCR突变率的因素易错PCR技术是结合随机突变与定向筛选，利用TaqDNA多聚酶不具有3`→5`校对功能的特点，在PCR反应中通过调节离子浓度等方法引入随机突变，在特定培养基或培养条件下定向选择所需酶的方法。从而获得天然生物催化剂所不具备的某些优良特性或产生新的催化能力[2]。为提高易错PCR引入突变的效率，常采用改变Mg2+、Mn2+离子浓度、调整4种的dNTPs比例、多轮扩增等方法。1.1离子浓度在PCR反应过程中，离子浓度对PCR扩增效率影响很大。Mg2+浓度过高可降低PCR扩增的特异性，稳定非互补配对的碱基对，增加产量；浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。Mn2+是很多DNA聚合酶的诱变因子，加入Mn2+可以降低聚合酶对模板的特异性，提高错配率。调整Mg2+和Mn2+离子浓度，可以获得不同突变频率的多样性文库[3]。标准易错PCR中Mg2+浓度为7mmol/L，而Mn2+浓度根据不同的模板和扩增片段长度的要求，浓度范围在0.1-0.5mmol/L之间。刘治江等[4]利用易错PCR方法进行酶体外进化研究，在优化易错PCR条件时设定了不同的Mg2+和Mn2+离子浓度，通过扩增片段电泳检测结果确定了最佳扩增效率的Mg2+和Mn2+离子浓度分别为7mmol/L和0.5mmol/L。由于Mn2+浓度受扩增片段的大小和扩增片段碱基组成等因素的影响，所以没有固定推荐的Mn2+浓度，建立不同Mn2+浓度梯度的PCR反应是优化易错PCR体系中最常采用的方法[5-9]。1.2四种dNTPs比例易错PCR体系中，4种dNTPs比例不是1:1:1:1，改变4种dNTPs的平衡，主要的目的是提高碱基错配的倾向性，降低扩增过程中聚合酶的保真性，获得更多的突变。易错PF的变化带有强烈的倾向性，碱基A、T突变为G和C的变异率高。有研究表明增加dTTP和dCTP浓度的致突变效果优于增加dATP和dGTP的效果[10,11]，因此在标准的易错PCR体系中4种dNTPs比例dATP\dGTP:dTTP\dCTP=1:5。为了简化易错PCR优化过程，高义平等[12]检测了在不添加Mn2+、不调整其它任何PCR成分，只降低1种dNTP浓度的条件下体外诱变，结果显示随着dATP浓度的降低，序列变异率和碱基突变率均成升高趋势，且主要引起AT→GC的变异。1.3多轮PCR易错PCR是一种简便快速的在DNA序列中随机引入突变的方法，是最常的无性突变技术。该技术的关键是控制诱导片段的突变率[13]。为了有效地积累有益突变，常采用二轮PCR的方法，以第一轮易错PCR产物为模板，不改变PCR体系的扩增条件进行第二轮PCR[14-16]。2.易错PCR在酶体外定向进化中的应用随着分子生物技术的发展，利用基于PCR的方法进行酶分子改造已经取得了大量突破性成果。通过定向进化对酶进行改造后显著提高了酶的特性，获得了特定功能的工业酶。利用该方法产生的突变型β-葡聚糖酶的最适pH由7.7变化至5.5，且保持了原有的耐热性和比酶活[17]。SPT3定向进化的菌株M25在10%的乙醇中生长良好，且提高了利用125g/L的葡萄糖进行乙醇发酵时的乙醇产量[9]。黄瑛等利用易错PCR方法得到的突变型脂肪酶其比活力比野生型脂肪酶提高了1.31倍[18]。β-甘露聚糖酶是一种半纤维素酶类，可水解半乳甘露聚糖等，可广泛用于造纸、印染等行业，吴秀秀等从易错PCR方法建立的β-甘露聚糖酶突变文库中筛选耐酸、耐高温的菌株，并结合DNA改组技术获得了特定条件下高酶活的菌株[19]。越来越多的研究利用易错PCR进行酶体外进化，这表明该技术是改造酶分子切实有效的方法，在酶的体外高效定向进化研究中有较好的应用前景。参考文献：[1]孙志浩,柳志强.酶的定向进化及其应用[J].生物加工过程,2005,03:7-13.[2]高义平,赵和,吕孟雨,杨学举,王海波.易错PCR研究进展及应用[J].核农学报,2013,05:607-612[3]汤晓玲，于洪巍.通过定向进化策略提高酯酶立体选择性的研究[J].高校化学工程学报.2011,25(2):283-288[4]刘治江，贺淹才，李红然,等.采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化.华侨大学学报(自然科学版),2010,31(1):58-64[5]张雯.易错PCR技术提高耐碱木聚糖酶xy/BYG耐热性的研究.硕士,西北农业科技大学,2012[6]王睿,喻晓蔚,徐岩.易错PCR提高华根霉脂肪酶的热稳定性.生物工程学报.2013,29(12):1753-1764[7]张赛,邢克克,胡亚冬,等.基于易错PCR的黄曲霉素解素酶体外分子定向进化.生物工程学报,2011,27(7):1100-1108[8]冯慧玲,李春梅,吴振芳,等.易错PCR技术提高黑由霉N25植酸酶活力的研究.生物技术通报.2010,10:227-231[9]赵心清,姜如娇,李宁,等.利用SPT3的定向进化提高工业酿酒酵母乙醇耐性.生物工程学报.2010,26(2):159-164[10]高义平,赵和,吕孟丽,等.易错PCR研究进展及应用.核农学报.2013,27(5):607-612[11]陈晓穗,汪保安,王琰.错配PCR致突变的实验条件研究[J].第二军医大学学报,2003,03:307-310.[12]高义平,赵和,吕孟雨,等.一种降低dATP用量的简单易错PCR方法[J].微生物学报,2014,54(1):97-103[13]苏怡丹,伍宁丰,刘国安.蛋白质定向进化技术的研究进展[J].生物技术通报.2009,11:43-47[14]黄亮,宋鹏,尹艳丽.等.嗜酸乳杆菌亚油酸异构酶基因定向进化研究[J].河南工业大学学报(自然科学版),2010,31(4):55-58[15]施碧红,陈明,翟妙仙,严蕾,陈文静.基于易错PCR定向进化扩展青霉PenicilliumexpansumFS1884碱性脂肪酶[J].中国生物工程杂志,2011,11:64-68.[16]荀启静,林瑛,邱沛然,孟清.定向进化提高微小蛋白质内含子TerDnaE-3剪接活性的研究[J].中国生物工程杂志,2012,05:79-84[17]李一男,贾会勇,闫巧娟,江正强,杨绍青.定向进化提高嗜热拟青霉J18耐热β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酸性条件下的催化能力[J].生物工程学报,2011,12:1797-1804.[18]黄瑛,蔡勇,杨江科,闫云君.基于易错PCR技术的短小芽孢杆菌YZ02脂肪酶基因BpL的定向进化[J].生物工程学报,2008,03:445-451.[19]吴秀秀,吕晓慧,胡亚冬,谢春芳,刘大岭,姚冬生.耐高温耐酸稳定假密环菌(Armillariellatabescens)MAN47β-甘露聚糖酶体外分子定向进化[J].中国生物工程杂志,2012,03:83-90.